構(gòu)建神經(jīng)生長(zhǎng)因子基因修飾的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 1.優(yōu)化大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rat bone marrow-derived mesenchymal stemcells，rBMSCs)體外分離、培養(yǎng)、純化、擴(kuò)增的方法。 2.將構(gòu)建成功的含有神經(jīng)生長(zhǎng)因子(Nerve growth factor，NGF)基因的慢病毒載體感染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并觀察神經(jīng)生長(zhǎng)因子在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)，為下一步在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行基因治療提供基礎(chǔ)。 方法： 1.全骨

2、髓貼壁培養(yǎng)法行rBMSCs提取、分離、培養(yǎng)，用低糖DMEM+10％胎牛血清作為細(xì)胞培養(yǎng)基，倒置顯微鏡下觀察rBMSCs形態(tài)及生長(zhǎng)，通過(guò)傳代純化和擴(kuò)增，至第二代以后每次傳代時(shí)取部分細(xì)胞分裝凍存。 2.取第三代rBMSCs流式細(xì)胞學(xué)鑒定其表面CD標(biāo)記并進(jìn)行成骨、成脂誘導(dǎo)分化鑒定。 3.以含有NGF基因的慢病毒載體和含有GFP的慢病毒空載體(作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照)，感染靶細(xì)胞rBMSCs，倒置熒光顯微鏡下觀察感染后的rBMSCs中GF

3、P表達(dá)情況。 4.以慢病毒空載體做對(duì)照，取感染后的rBMSCs培養(yǎng)液上清采用ELISA檢測(cè)rBMSCs中NGF蛋白的表達(dá)。 5.以慢病毒空載體做對(duì)照，取感染后的rBMSCs提取RNA后行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)rBMSCs NGF基因mRNA水平的表達(dá)。 結(jié)果： 1.全骨髓培養(yǎng)法采集和擴(kuò)增的rBMSCs生長(zhǎng)良好并穩(wěn)定傳代，細(xì)胞培養(yǎng)至第3代后呈現(xiàn)比較均一的長(zhǎng)梭形、成纖維狀形態(tài)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)擴(kuò)增后的rBMSC

4、s表面抗原特征，結(jié)果表明rBMSCs強(qiáng)表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)記CD44、CD90、CD106，而弱表達(dá)甚至不表達(dá)造血干細(xì)胞特異抗原CD34、CD45等，并且能向成骨、成脂誘導(dǎo)分化，證實(shí)為非造血干細(xì)胞的另一類干細(xì)胞。 2.在感染入含神經(jīng)生長(zhǎng)因子基因的慢病毒載體的rBMSCs中，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR可檢測(cè)到NGF前體基因的mRNA，其培養(yǎng)液上清應(yīng)用ELISA方法可檢測(cè)到NGF蛋白。 結(jié)論： 1.通過(guò)全骨髓培養(yǎng)法貼壁篩選成