bFGF基因修飾雪旺細(xì)胞bFGF表達(dá)的實驗研究.pdf

1、堿性成纖維細(xì)胞生長因子bFGF(FGF-2)是FGF家族的成員之一，具有促血管形成、誘導(dǎo)胚胎發(fā)育、促進神經(jīng)生長等功能，bFGF在體內(nèi)分布廣泛，尤其是在神經(jīng)組織中含量豐富。目前已經(jīng)有大量的研究證實堿性成纖維細(xì)胞生長因子對脊髓損傷(SCI)的再生和修復(fù)具有重要作用，但由于急性脊髓損傷后bFGFR表達(dá)時程早于bFGF轉(zhuǎn)錄合成增加，因此限制了機體內(nèi)源性bFGF發(fā)揮保護缺血損傷神經(jīng)元的作用，這提示治療脊髓損傷時需在bFGFR高表達(dá)時程提供足夠bF

2、GF。而通過局部或全身給予外源性bFGF均難以達(dá)到理想的治療效果，本研究正是為解決這一問題而作的基礎(chǔ)研究。將bFGF基因以質(zhì)粒pcDNA3.1為載體，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入雪旺細(xì)胞(SC)，使外源bFGF基因能持續(xù)穩(wěn)定高表達(dá)，在體內(nèi)合成分泌bFGF，這將可能為損傷脊髓及時提供足量bFGF、為改善脊髓損傷局部微環(huán)境奠定基礎(chǔ)。 本文的研究內(nèi)容主要包括以下三個部分： 1、用混合酶消化法獲取高純度的雪旺細(xì)胞： 2、PCR擴

3、增bFGF基因片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒bFGF-pcDNA3.1; 3、將pcDNA3.1-bFGF質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入雪旺細(xì)胞，用ELISA方法檢測實驗組、空載體組及空白對照組雪旺細(xì)胞培養(yǎng)上清中bFGF的表達(dá)水平；應(yīng)用RT-PCR方法檢測外源基因bFGFmRNA的表達(dá)情況。 結(jié)果： 1、通過大鼠坐骨神經(jīng)預(yù)變性、混合酶消化法及G-418篩選，可以培養(yǎng)獲取高純度的雪旺細(xì)胞。 2、選擇安全性較高的高拷貝真核表達(dá)

4、載體pcDNA3.1，可以將外源性bFGF基因片段與pcDNA3.1進行重組，獲取含目的基因片段的真核表達(dá)體系。 3、將重組bFGF-pcDNA3.1質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入雪旺細(xì)胞后外源性bFGF基因能即時、持續(xù)、穩(wěn)定表達(dá)，極大提高bFGF的表達(dá)水平。 結(jié)論：(1)將bFGF基因以pcDNA3.1為載體通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染導(dǎo)入雪旺細(xì)胞，能使雪旺細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中表達(dá)分泌bFGF；(2)經(jīng)過bFGF基因修飾的雪旺細(xì)胞能持續(xù)穩(wěn)