黃芪抗腦缺血及其增強腦缺血耐受的實驗研究.pdf

1、目的：通過動物實驗證實黃芪具有抗腦缺血損傷以及增強腦預(yù)缺血(cerebral ischemic preconditioning，CIP)腦保護效果、促進腦缺血耐受形成的作用，并從調(diào)控凋亡相關(guān)基因Bax、bcl-2蛋白表達，抑制細(xì)胞凋亡，以及調(diào)節(jié)星型膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte，AST)活化狀態(tài)等角度，初步探討其作用機制，進一步為臨床使用黃芪預(yù)防和治療腦缺血性疾病提供實驗依據(jù)。 方法: 第一部 分黃芪抗腦缺血及CI

2、P腦保護作用的實驗研究將96只昆明小鼠隨機分為假手術(shù)組、缺血損傷組、BIT模型組和黃芪預(yù)防組，每組n=24。黃芪預(yù)防組腹腔注射黃芪注射液3.3ml/kg，1次/日，連續(xù)3d；假手術(shù)組、缺血損傷組和BIT模型組腹腔注射等量生理鹽水。初次給藥1h后，BIT模型組夾閉雙側(cè)頸總動脈6min作為預(yù)缺血，然后恢復(fù)灌流；其余各組只暴露雙頸總動脈不阻斷血流。末次給藥1h后，缺血損傷組、BIT模型組和黃芪預(yù)防組均阻斷雙側(cè)頸總動脈血流20min，然后恢復(fù)灌

3、流；假手術(shù)組只暴露頸總動脈不阻斷血流。術(shù)后24h從各組隨機選取12只小鼠斷頭剝?nèi)∪X，多聚甲醛固定，石蠟切片，免疫組化檢測海馬Bax、bcl-2蛋白表達。其余小鼠于術(shù)后7d全部處死，剝?nèi)∪X，冠狀切取視交叉后1至4mm腦片，多聚甲醛固定，石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察海馬CAl區(qū)組織學(xué)分級和神經(jīng)元密度(neuronal density，ND)，并進行GFAP免疫組化和TUNEL細(xì)胞凋亡檢測。 第二部 分黃芪協(xié)同CIP增強

4、腦缺血耐受的實驗研究將120只昆明小鼠隨機分為假手術(shù)組、缺血損傷組、BIT模型組、黃芪預(yù)防組和黃芪干預(yù)組，每組n=24。黃芪預(yù)防組和黃芪干預(yù)組腹腔注射黃芪注射液，每次3.3ml/kg，1次/日，連續(xù)3d；假手術(shù)組、缺血損傷組和BIT模型組腹腔注射等量生理鹽水。初次給藥1h后，BIT模型組和黃芪干預(yù)組夾閉雙側(cè)頸總動脈6min作為預(yù)缺血，然后恢復(fù)灌流；其余各組只暴露雙側(cè)頸總動脈不阻斷血流。末次給藥1h后，缺血損傷組、BIT模型組、黃芪預(yù)防組

5、和黃芪干預(yù)組均阻斷雙側(cè)頸總動脈血流40min，然后恢復(fù)灌流；假手術(shù)組只暴露頸總動脈不阻斷血流。術(shù)后24h從各組隨機選取12只小鼠斷頭剝?nèi)∪X，多聚甲醛固定，石蠟切片，免疫組化檢測海馬Bax、bcl-2蛋白表達。其余小鼠于術(shù)后7d全部處死，剝?nèi)∪X，冠狀切取視交叉后1至4mm腦片，多聚甲醛固定，石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察海馬CA1區(qū)組織學(xué)分級和神經(jīng)元密度(neuronal density,ND)，并進行GFAP免疫組化和TUNEL細(xì)胞

6、凋亡檢測。 結(jié)果: 第一部分黃芪抗腦缺血及CIP腦保護作用的實驗研究。 1.術(shù)后7d海馬CA1區(qū)組織病理學(xué)改變光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組海馬CA1區(qū)無明顯組織學(xué)損傷，組織學(xué)分級多為0級或1級。缺血損傷組海馬CA1區(qū)損傷明顯，主要表現(xiàn)為錐體細(xì)胞缺失較多，殘存的錐體細(xì)胞排列紊亂，多數(shù)錐體細(xì)胞體積縮小，胞核固縮，染色較深，組織學(xué)分級多為2級或3級，與假手術(shù)組相比有顯著性差異(P<0.05)。BIT模型組和黃芪預(yù)防組海馬CA

7、1區(qū)組織學(xué)損傷輕微，偶有散在的神經(jīng)元缺失，胞核固縮，組織學(xué)分級多為1級或0級，與缺血損傷組相比差異顯著(P<0.05)。 通過計算海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度得知，假手術(shù)組(ND=216±18 n/mm)、BIT模型組(ND=154±19 n/mm)和黃芪預(yù)防組(ND=160±18 n/mm)神經(jīng)元密度均明顯高于缺血損傷組(ND=74±7 n/mm，P<0.01)。 2.術(shù)后7d海馬CAl區(qū)GFAP表達的變化光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，假手

8、術(shù)組海馬CA1區(qū)GFAP表達陰性或僅見少量表達。與假手術(shù)組相比，缺血損傷組海馬CA1區(qū)GFAP呈弱陽性表達，表現(xiàn)為星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體瘦小且數(shù)目較少，染色較淺。與缺血組相比，BIT模型組和黃芪預(yù)防組海馬CA1區(qū)GFAP活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目明顯增多，胞體肥大，突起明顯增多增長，多呈中等陽性或強陽性表達。 3.術(shù)后24h海馬CA1區(qū)Bax和bcl-2蛋白表達變化假手術(shù)組Bax蛋白多見陰性或微弱表達，bcl-2未見明顯表達。與假手術(shù)組相

9、比，缺血損傷組Bax表達明顯增多，呈中等陽性(P<0.01)；bcl-2表達可見有增多趨勢，多呈弱陽性表達(P>0.05)。與缺血損傷組相比，BIT模型組和黃芪預(yù)防組Bax表達明顯減少，呈弱陽性表達，(P<0.05)；bcl-2表達明顯增多，呈強陽性表達(P<0.05)。 4.術(shù)后7d海馬CA1區(qū)TUNEL標(biāo)記凋亡細(xì)胞的變化假手術(shù)組未見或偶見標(biāo)記的陽性細(xì)胞。與假手術(shù)組相比，缺血損傷組可見TUNEL標(biāo)記的陽性細(xì)胞數(shù)目明顯增多，胞核

10、被染成棕黃色，細(xì)胞間隙增大，排列不規(guī)則。與缺血組相比，BIT模型組和黃芪預(yù)防組陽性細(xì)胞數(shù)目的表達明顯減少。 第二部分黃芪協(xié)同CIP增強腦缺血耐受的實驗研究。 1.術(shù)后7d海馬CAl區(qū)組織病理學(xué)改變假手術(shù)組海馬CA1區(qū)無明顯組織學(xué)損傷，組織學(xué)分級多為0級或1級，神經(jīng)元密度ND=216±18 n/mm。缺血損傷組海馬CA1區(qū)損傷明顯，組織學(xué)分級多為2級或3級，神經(jīng)元密度為ND=59±9 n/mm，與假手術(shù)組相比有顯著性差異(

11、P<0.01)。BIT模型組和黃芪預(yù)防組海馬CA1區(qū)損傷明顯，組織學(xué)分級多為2級或3級，ND=59±13 n/mm和ND=62±13 n/mm，二者之間無顯著性差異(P>0.05)；與假手術(shù)組相比，有顯著性差異(P<0.05)；與缺血損傷組相比無顯著性差異(P>0.05)。黃芪干預(yù)組海馬CA1區(qū)組織學(xué)分級多為1級或2級，明顯低于缺血損傷組(P<0.01)、BIT模型組(P<0.05)和黃芪預(yù)防組(P<0.05)，又明顯高于假手術(shù)組(P<

12、0.05)；神經(jīng)元密度(ND=114±2 n/mm)明顯高于缺血損傷組(P<0.01)、BIT模型組(P<0.05)和黃芪預(yù)防組(P<0.05)，又明顯低于假手術(shù)組(P<0.05)。 2.術(shù)后7d海馬CAl區(qū)GFAP表達的變化光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組海馬CA1區(qū)GFAP表達為陰性或僅見少量表達。與假手術(shù)組相比，缺血損傷組、BIT模型組和黃芪預(yù)防組海馬CA1區(qū)GFAP呈弱陽性表達或中等陽性表達，三者之間無明顯差異。黃芪干預(yù)組海馬CA

13、1區(qū)GFAP表達多呈強陽性表達，與缺血損傷組、BIT模型組和黃芪預(yù)防組相比有明顯差異。 3.術(shù)后24d海馬CAl區(qū)Bax和bcl-2蛋白表達變化與假手術(shù)組相比，缺血損傷組、BIT模型組和黃芪預(yù)防組Bax表達明顯增多，多呈強陽性；bcl-2表達亦明顯增多，多為弱陽性或中等陽性，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但三者之間無顯著性差異(P>0.05)。與缺血損傷組、BIT模型組和黃芪預(yù)防組相比，黃芪干預(yù)組Bax表達明顯減少，多為弱陽性或

14、中等陽性(P<0.05)；bcl-2表達明顯增多，多為中等陽性或強陽性(P<0.05)。 4.術(shù)后7d海馬CA1區(qū)TUNEL標(biāo)記凋亡細(xì)胞的變化與假手術(shù)組相比，缺血損傷組、BIT模型組和黃芪預(yù)防組可見TUNEL標(biāo)記的陽性細(xì)胞數(shù)目明顯增多，胞核可見大量棕褐色標(biāo)記物，可見到大量的胞核固縮，但三者之間無明顯差異。與缺血損傷組、BIT模型組和黃芪預(yù)防組相比，黃芪干預(yù)組可見陽性細(xì)胞數(shù)目的表達明顯減少，但較假手術(shù)組表達明顯增多。 結(jié)論

15、: 1. 通過夾閉雙頸總動脈導(dǎo)致小鼠前腦缺血20min，可引起明顯的海馬組織損傷，腦缺血40min可使海馬組織損傷有加重趨勢，而黃芪對腦缺血引起的小鼠海馬組織損傷具有明顯的保護作用。 2. 黃芪能夠明顯增強海馬CA1區(qū)bcl-2蛋白表達，降低Bax蛋白表達，上調(diào)bcl-2/Bax比例，從而抑制細(xì)胞凋亡，減輕腦缺血引起的海馬神經(jīng)元損傷；同時，黃芪能夠明顯上調(diào)缺血腦組織GFAP表達，增強星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài)，從而起到保護神

16、經(jīng)元的作用。這些可能是本方抗腦缺血損傷的部分機制。 3.以6min腦缺血作為預(yù)處理(CIP)，可對間隔2d后20min腦缺血引起的海馬神經(jīng)元損傷產(chǎn)生一定的保護作用。但是，6min CIP的腦保護作用是有限的，對后續(xù)40min腦缺血引起的海馬神經(jīng)元損傷幾乎不產(chǎn)生保護，而黃芪能夠?qū)IP產(chǎn)生良性干預(yù)效應(yīng)，增強其腦保護作用，促進腦缺血耐受形成。 4.在CIP誘導(dǎo)BIT形成過程中，通過黃芪的干預(yù)，能夠使海馬CA1區(qū)bcl-2表達