TRPM8通道對Zmpste24---小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖-凋亡的影響.pdf

1、Hutchinson—Gilford早老癥(HGPS)是一種罕見的遺傳性疾病，其臨床特征為患者幼年時期即出現(xiàn)衰老癥狀并累及多種組織器官，包括皮膚、肌肉、骨骼以及心血管系統(tǒng)。HGPS伴發(fā)有老年人常見的并發(fā)癥，并最終導(dǎo)致死亡，該疾病患兒的平均壽命約13.5歲。HGPS是由于LMNA基因的點(diǎn)突變干擾了A型核纖層蛋白前體(prelaminA)翻譯后的加工過程，從而導(dǎo)致異常prelaminA在細(xì)胞核堆積的結(jié)果。Zmpste24是參與由prelam

2、inA形成成熟的核纖層蛋白A（laminA）過程所必須的酶。Zmpste24基因敲除小鼠具有典型的早老表現(xiàn)，是目前研究細(xì)胞衰老機(jī)制的首選模型。瞬時性受體電位通道(transient receptor potential，TRP)是參與調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣離子平衡的一種通道，廣泛表達(dá)于哺乳動物的多種組織中，并參與調(diào)節(jié)例如細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、遞質(zhì)釋放、細(xì)胞分化、基因轉(zhuǎn)錄等諸多重要的生理功能。研究發(fā)現(xiàn)由早老癥患者的內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞高表達(dá)TRPV

3、2，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，與細(xì)胞衰老密切相關(guān)。但是TRP通道對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow mesenehymal stem cells， BMMSCs）功能的影響尚少有報(bào)道，并且TRP通道如何影響細(xì)胞衰老的機(jī)制也尚不明確。細(xì)胞衰老涉及毒性代謝物的積累、DNA損傷、線粒體代謝紊亂等方面，這些衰老的表現(xiàn)都與氧化應(yīng)激相關(guān)。因此本實(shí)驗(yàn)通過比較Zmpste24-/-早老小鼠與野生型小鼠BMMSCs的衰老情況、增殖能力、凋亡水平、TRP通

4、道的表達(dá)情況以及TRP通道與氧化應(yīng)激的關(guān)系，進(jìn)一步探討TRP通道對于細(xì)胞衰老的影響及其可能存在的調(diào)控機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　1.比較Zmpste24-/-基因敲除、野生型小鼠BMMSCs的衰老情況、增殖能力和凋亡水平；
　　2.比較Zmpste24-/-基因敲除、野生型小鼠BMMSCs的TRP通道表達(dá)情況，篩選與細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)的TRP通道；
　　3.初步探討TRP通道影響細(xì)胞增殖凋亡的機(jī)制。
　　實(shí)

5、驗(yàn)方法：
　　1.利用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)、純化Zmpste24-/-、野生型小鼠BMMSCs，流式鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志物，并進(jìn)行克隆形成的鑒定；
　　2.利用Edu檢測兩種小鼠BMMSCs的增殖能力，流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞周期的情況；AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測凋亡能力，β-半乳糖苷酶染色檢測兩種小鼠BMMSCs的細(xì)胞衰老情況；RT-PCR檢測BMMSCs的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1、CDK1、

6、CDK4、CDK6及衰老相關(guān)基因P16、P21、P53的表達(dá)水平。
　　3. RT-PCR檢測兩種小鼠BMMSCs的TRP通道表達(dá)情況，通過無血清培養(yǎng)（抑制增殖）和H2O2處理（促進(jìn)細(xì)胞凋亡）篩選出影響B(tài)MMSCs增殖凋亡的TRP通道；并通過Western-Blot技術(shù)檢測該通道的表達(dá)；
　　4.抑制TRPM8通道的表達(dá)檢測BMMSCs細(xì)胞增殖能力及氧化應(yīng)激水平的變化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.分離純化后，WT的

7、BMMSCs呈梭形，細(xì)胞個體小，細(xì)胞立體感強(qiáng)；Zmpste24-/-的BMMSCs細(xì)胞呈扁平形，個體較大，立體感差；兩種小鼠的BMMSCs均陽性表達(dá)Sca-1、CD73，陰性表達(dá)CD34、CD45，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特性；Zmpste24-/-、WT小鼠的BMMSCs通過克隆均能形成集落，其中Zmpste24-/-小鼠的BMMSCs形成集落速度慢，集落數(shù)目少，WT小鼠的BMMSCs形成的集落染色深，大于50個細(xì)胞的集落數(shù)目較多（p<0.

8、05）。
　　2. Edu檢測結(jié)果顯示，Zmpste24-/-小鼠BMMSCs的增殖能力明顯低于WT（p<0.05）;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期結(jié)果顯示Zmpste24-/-小鼠BMMSCs G0/G1期細(xì)胞所占比例比WT高，G2期、S期細(xì)胞所占比例均比WT低（p<0.05）。 FITC/PI雙染法結(jié)果顯示Zmpste24-/-小鼠BMMSCs凋亡水平明顯高于WT（p<0.05）；SA-β-gal染色顯示，Zmpste24-/-小鼠B

9、MMSCs的衰老細(xì)胞數(shù)目明顯多于WT（p<0.05）。RT-PCR結(jié)果顯示：Zmpste24-/-小鼠BMMSCs的CyclinD1、CDK1、CDK4、CDK6的表達(dá)水平低于WT小鼠（p<0.05），而P16、P21、P53基因的表達(dá)水平明顯高于WT小鼠（p<0.05）。
　　3. RT-PCR檢測結(jié)果顯示，Zmpste24-/-小鼠BMMSCs中的TRPC1、TRPM4、TRPM8、TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV

10、5通道表達(dá)水平均明顯高于WT小鼠（p<0.05）。對WT的BMMSCs進(jìn)行12h的無血清培養(yǎng)后TRPC3、TRPC7、TRPM8、TRPV5的表達(dá)水平顯著升高（p<0.05）；含500μmol/L H2O2的培養(yǎng)液處理12h后TRPM8、TRPV3表達(dá)水平明顯升高（p<0.05）。 Western-Blot檢測結(jié)果顯示：Zmpste24-/-小鼠的BMMSCs TRPM8蛋白表達(dá)水平高于WT小鼠。
　　4. Zmpste24-/-

11、小鼠BMMSCs高表達(dá)MDA，而SOD2、CAT的表達(dá)水平明顯低于WT小鼠（p<0.05）；2-APB抑制TRPM8表達(dá)后Zmpste24-/-小鼠BMMSCs的G1期細(xì)胞比例下降，G2+M期細(xì)胞比例增加（p<0.05）；SOD2、CAT的表達(dá)水平明顯升高（p<0.05），MDA的表達(dá)水平明顯降低（p<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1. Zmpste24-/-小鼠BMMSCs出現(xiàn)衰老細(xì)胞的特征，表現(xiàn)為細(xì)胞扁平形，個體較大；克

12、隆形成能力差，增殖能力低，凋亡水平高，處于有絲分裂期的細(xì)胞數(shù)目少，低表達(dá)CyclinD1、CDK1、CDK4、CDK6，高表達(dá)P16、P21、P53；高表達(dá)MDA，低表達(dá)SOD2，CAT，細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。
　　2. Zmpste24-/-小鼠BMMSCs高表達(dá)TRPM8且TRPM8與H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān)。
　　3.抑制TRPM8的表達(dá)后Zmpste24-/-小鼠BMMSCs增殖能力提高，細(xì)胞氧化應(yīng)激水平降低，抗氧