自噬在甲基汞致星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷中的作用研究.pdf

1、目的:甲基汞是一種全球性環(huán)境污染物，是無機(jī)汞通過微生物和植物的生物轉(zhuǎn)化而生成，人體的主要暴露途徑為食用被甲基汞污染的魚貝類和稻米。甲基汞對(duì)人體各組織系統(tǒng)如神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等都會(huì)產(chǎn)生損害，其最主要靶器官為神經(jīng)系統(tǒng)，因其脂溶性大，因而可以穿過血腦屏障和胎盤，會(huì)造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)不可逆的損傷，影響胎兒的正常發(fā)育。目前，甲基汞的毒性機(jī)制尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)以原代大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞為研究對(duì)象，探索:1.甲基汞對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的毒性;2.自

2、噬在甲基汞致星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷中的作用;3.甲基汞誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡情況;4.利用抗氧化劑預(yù)處理探討甲基汞可能的毒性機(jī)理。最終為明確甲基汞致毒機(jī)制，為甲基汞中毒的預(yù)防與治療提供理論基礎(chǔ)。
　　方法:1.甲基汞處理原代培養(yǎng)的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞，通過MTT法檢測(cè)甲基汞對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響，LDH漏出率檢測(cè)甲基汞的細(xì)胞毒性，研究不同濃度(0、1、2、5、10μmol/L)以及不同處理時(shí)間(0、3、6、12、24 hrs)，甲基汞對(duì)星

3、形膠質(zhì)細(xì)胞的影響。2.甲基汞（5μmol/L，6hrs）處理星形膠質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)吖啶橙(AO)染色與蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)酸性囊泡的形成以及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)，確定細(xì)胞自噬的發(fā)生。3.不同濃度甲基汞（0、1、5、10μmol/L）處理星形膠質(zhì)細(xì)胞6小時(shí)，用Annixin V FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)甲基汞誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡率。4.不同濃度甲基汞(0、1、5、10μmol/L)處理星形膠質(zhì)細(xì)胞6小時(shí)，然后采取蛋白印跡法檢測(cè)甲基汞處

4、理星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞中自噬與凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的劑量-效應(yīng)關(guān)系。5.采用雷帕霉素（rapamycin）誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和3-甲基腺嘌呤(3-MA)，氯喹(CQ)，Atg5 siRNA基因干擾抑制細(xì)胞自噬等實(shí)驗(yàn)手段調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬水平，隨后用MTT法與蛋白印跡法觀察調(diào)節(jié)自噬對(duì)甲基汞致星形膠質(zhì)細(xì)胞毒性的影響以及自噬、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況，以及Annixin V FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡，評(píng)價(jià)自噬的調(diào)控對(duì)甲基汞誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響。6

5、.利用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)預(yù)處理(5mmol/L，4hrs)，MTT法檢測(cè)甲基汞處理下星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞活力的變化來研究抗氧化劑對(duì)甲基汞毒性及甲基汞誘導(dǎo)自噬的影響，探討甲基汞可能的作用機(jī)制。
　　結(jié)果:1.甲基汞對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，并且呈濃度時(shí)間依賴性;2.吖啶橙(AO)染色，蛋白免疫印跡與Annixin V FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示甲基汞處理星形膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)顯著地誘導(dǎo)細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡的發(fā)生(P

6、＜0.05)，并且隨著甲基汞處理濃度的升高，星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞凋亡比例也隨之上升，具有濃度依賴關(guān)系;3.蛋白印跡分析結(jié)果顯示不同濃度甲基汞處理下，自噬標(biāo)志性蛋白LC3II的轉(zhuǎn)換，Beclin1，P62/SQSTM1的蛋白水平顯著上升(P＜0.05)，并且隨著甲基汞濃度的增大，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì);4.用自噬特異性抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)，氯喹(CQ)及Atg5 siRNA基因干擾預(yù)處理細(xì)胞后，細(xì)胞自噬標(biāo)志性蛋白表達(dá)降低，差異具有

7、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且抑制細(xì)胞自噬可增強(qiáng)甲基汞的細(xì)胞毒性;5.自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素（rapamycin）預(yù)處理則顯著地增強(qiáng)細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白的表達(dá)(P＜0.05)，減輕甲基汞的細(xì)胞毒性;6.N-乙酰半胱氨酸(NAC)預(yù)處理減弱甲基汞誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞活力的降低并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，同時(shí)抑制甲基汞誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。
　　結(jié)論:甲基汞可誘導(dǎo)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞中自噬的發(fā)生，細(xì)胞自噬在甲基汞誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性中的作用為應(yīng)激性適