重組葡萄球菌腸毒素對豬先天免疫功能的影響.pdf

1、葡萄球菌腸毒素（SEs）作為超抗原能促進淋巴細胞增殖，引起機體廣泛的炎癥反應(yīng)。腸毒素作用迅速、產(chǎn)生炎癥能力強，暗示其可能影響先天免疫應(yīng)答機制介導(dǎo)適應(yīng)性免疫，促進炎癥的產(chǎn)生。Toll樣受體（TLRs)作為先天免疫模式識別受體，在先天性早期抗感染、炎癥反應(yīng)及調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫中有重要作用，但TLRs對葡萄球菌腸毒素刺激的應(yīng)答反應(yīng)尚不清楚。本文研究了重組葡萄球菌腸毒素對豬先天性免疫分子TLR轉(zhuǎn)錄表達、其介導(dǎo)的炎癥因子表達的影響，以探討腸毒素引發(fā)先

2、天免疫應(yīng)答的分子機制，主要研究結(jié)果如下：
　　應(yīng)用RT-PCR方法從豬肺泡巨噬細胞中克隆了8種Toll樣受體（TLR1、2、4、5、6、8、9、10）全基因，利用生物信息學(xué)技術(shù)分析其單核苷酸多態(tài)性（SNPs）和氨基酸功能區(qū)，預(yù)測TLR蛋白高級結(jié)構(gòu)及其配體識別域，從結(jié)構(gòu)角度分析突變氨基酸對TLR功能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TLR基因序列具有個體差異性和種屬特異性，其非同義突變主要位于胞外區(qū)，推測其病原識別具有多樣性。預(yù)測的8種TLR分子均為

3、I型跨膜蛋白，胞外區(qū)富含亮氨酸重復(fù)序列（LRRs）；二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、β-折疊組成；TLR單體和二聚體分別為馬蹄形和“M”形。
　　設(shè)計TLR1-10及先天免疫應(yīng)答相關(guān)分子IL-1β、MCP-1、MIP-1β、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4的特異性引物，建立了檢測上述分子轉(zhuǎn)錄變化的相對熒光定量PCR方法（qRT-PCR），從特異性、敏感性、重復(fù)性等方面優(yōu)化了PCR條件。結(jié)果顯示退火溫度為50℃時，c

4、DNA濃度在初始濃度或2倍稀釋時，各因子Ct值處于最適范圍且熒光強度高，溶解度曲線無雜峰，產(chǎn)物電泳條帶單一，各基因組間和組內(nèi)重復(fù)性實驗變異系數(shù)均保持在3.5％以內(nèi)。
　　運用相對熒光定量PCR和ELISA分別檢測了腸毒素對豬先天免疫分子TLR1-10、多種細胞因子體內(nèi)外轉(zhuǎn)錄、表達的影響。MTT實驗表明葡萄球菌腸毒素可促進豬淋巴細胞增殖，腸毒素可導(dǎo)致體外培養(yǎng)的肺泡巨噬細胞TLR1、2、6、10 mRNA轉(zhuǎn)錄顯著增加，通過活化TLR途

5、徑產(chǎn)生大量促炎因子，如IL-1β、TNF-α、克隆刺激因子（GM-CSF）、趨化因子（MCP-1）及炎性因子MIP-1β、IL-2、IL-4、IFN-γ等；體內(nèi)檢測的外周血淋巴細胞（PBMC）轉(zhuǎn)錄TLR1-10、MCP-1、IL-2、IL-4、IFN-γ等的能力增強，形成細胞因子風(fēng)暴。通過注射不同腸毒素的腸結(jié)扎實驗表明，5種腸毒素（SEU除外）均能引起豬小腸不同程度的水腫，炎性細胞增多，細胞間隙增大；不同腸毒素處理腸段TLR6轉(zhuǎn)錄均上調(diào)