重組葡萄球菌腸毒素SEA和SEO單克隆抗體的研制.pdf

1、葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal enterotoxins,SEs)是由葡萄球菌產(chǎn)生的、已超過(guò)20種基因型報(bào)道的、氨基酸序列和結(jié)構(gòu)相似,具有潛在超抗原活性的一組食源性致病毒素。目前對(duì)新發(fā)現(xiàn)腸毒素結(jié)構(gòu)、功能活性的認(rèn)識(shí)和不同型腸毒素的檢測(cè)鑒別尚缺乏有效手段。制備型特異性單抗對(duì)認(rèn)識(shí)不同型腸毒素的結(jié)構(gòu)和功能、不同毒素的檢測(cè)鑒別、分析腸毒素基因簇的表達(dá)調(diào)控機(jī)制等具有重要意義。本研究通過(guò)構(gòu)建葡萄球菌腸毒素A(SEA)和O(SEO)的原核

2、表達(dá)載體,應(yīng)用純化的重組葡萄球菌腸毒素制備了兩種腸毒素單克隆抗體,并對(duì)單抗特性做了研究。
　　 應(yīng)用克隆的腸毒素基因sea、selo構(gòu)建pET28α原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化重組菌BL21(DE3)表達(dá),經(jīng)鎳鰲合層析純化獲得可溶性重組蛋白SEA-His、SEO-His。
　　 應(yīng)用已構(gòu)建的pEGX-6P-SEA和pEGX-6P-SEO表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌BL21,經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)、親和層析純化獲得SEA-GST、SEO-GST重組蛋白,

3、以此蛋白為免疫原免疫8周齡Balb／c小鼠,3次免疫后取其脾細(xì)胞與SP2／0骨髓瘤細(xì)胞融合,制備雜交瘤細(xì)胞。以SEA-His、SEO-His為包被蛋白建立間接ELISA方法篩選陽(yáng)性克隆,陽(yáng)性率分別為8.5％(34／400)、5.3％(24／450)。有限稀釋法對(duì)SEA腸毒素陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞4A2,SEO腸毒素陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞5C12、8C7進(jìn)一步亞克隆,獲得穩(wěn)定分泌抗重組腸毒素蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為A型:4A2-C5、4A

4、2-B10；O型:5C12-C3、5C12-B4、8C7-G2、8C7-H8。
　　 對(duì)亞克隆獲得的雜交瘤細(xì)胞株分泌的單抗特性進(jìn)行了研究。經(jīng)間接ELISA檢測(cè),4A2-C5、5C12-C3、8C7-G2雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)分別為1:1600、1:1600、1:6400,腹水效價(jià)分別達(dá)1:6.4×103、1:5.12×104、1:1.024×105；3株單克隆抗體4A2-C5、8C7-G2、5C12-C3親和常數(shù)分別為3.35×

5、106、1.89×106、1.45×106；亞類(lèi)鑒定結(jié)果顯示,4A2-C5、5C12-C3為IgG2b亞類(lèi)；8C7-G2為IgM亞類(lèi)。競(jìng)爭(zhēng)ELISA對(duì)單抗識(shí)別抗原位點(diǎn)的分析結(jié)果表明,5C12-C3和8C7-G2分別識(shí)別SEO蛋白的不同抗原表位；Western blotting表明獲得的3株單克隆抗體均能識(shí)別相應(yīng)重組蛋白的B細(xì)胞線性表位；應(yīng)用SEB和SEC1腸毒素陽(yáng)性血清的阻斷ELISA結(jié)果表明,SEA、SEO、SEB和SEC1腸毒素間存