成骨誘導骨髓間充質干細胞與AW生物活性玻璃陶瓷多孔支架材料復合的體內外研究.pdf

1、臨床上由于嚴重創(chuàng)傷、腫瘤切除、感染以及發(fā)育異常等原因而導致的骨缺損發(fā)病率較高。骨缺損是指由于外傷、感染、腫瘤切除等因素造成骨質喪失，從而在骨組織中形成間隙。較小范圍的骨缺損可以由機體自身的再生得到修復，而較大間隙的骨缺損則由于成骨細胞難以越過而不能正常愈合，若不采用適當治療則最終僅由纖維組織充填，形成骨不連。有研究表明，當長骨骨干缺損長度超過其直徑的1.5～2.5倍時，機體便難以自行愈合，因而造成永久性骨不連。骨缺損的病人在骨科患者中占

2、有很高的比例，大約有10～15％的病人需要進行骨移植治療。如何利用現(xiàn)代高科技，研究用于骨缺損修復的生物材料，解除患者痛苦，是骨科臨床和生物材料研究者們關注的課題。 骨組織工程學是利用組織工程學原理對骨缺損進行修復或重建的一門學科。近年來，將種子細胞與支架材料復合，在體外構建生物復合材料是骨組織工程學研究的熱點。理想的生物復合材料應在保證材料力學性能的同時，具有良好的生物相容性和多孔相通性，以支持細胞的生長和功能的表達，為血管、神

3、經的生長，營養(yǎng)物質的輸送以及代謝產物的排出提供空間，促進骨組織的生長。目前應用較廣泛的種子細胞為骨髓間充質干細胞（Mesenchymal stem cells,MSCs），其作為組織工程的優(yōu)秀種子細胞之一，具有很強的成骨分化潛力，在誘骨環(huán)境下能夠被誘導分化成為成骨細胞，促進骨修復過程，因此被廣泛應用于骨組織工程領域。而支架材料多選用生物活性材料及生物復合材料。近年來，將細胞與特定支架材料聯(lián)合培養(yǎng)，形成具有生命的活性組織工程化復合材料用于

4、修復骨缺損已經取得了初步成效，但許多研究表明，單純的MSCs與材料的復合物誘導骨化過程很慢，毫無疑問，如何構建更理想的組織工程化人工骨已成為一個值得被重視的熱點。 方法 1．在本實驗前期工作中，我們已采用密度梯度離心法分離和培養(yǎng)大鼠骨髓間充質干細胞（rat mesenchymal stem ceils，rMSCs），誘導其向成骨方向分化，并挑選出處于最佳時期的細胞作為種子細胞。用溶膠凝膠法制備前驅體粉末，以硬脂酸為成孔劑

5、，經混料、模壓成型、干燥及高溫燒結步驟制備AW生物活性玻璃陶瓷多孔支架材料；分別選用不同孔隙率、不同孔徑和不同粗糙度的支架材料與種子細胞（成骨誘導后的rMSCs）復合，通過比較不同支架材料對種子細胞生長、增殖以及分化的影響來篩選最佳工藝參數(shù)的支架材料。 2．將成骨誘導后的rMSCs／材料復合物，未誘導的rMS／材料復合物以及單純的支架材料分別植入到裸鼠大腿肌袋內，觀察他們在體內異位成骨的情況，以挑選體內成骨能力最強的新型生物復合

6、材料。 3．使用密度梯度離心法分離成年犬骨髓間充質干細胞進行培養(yǎng)，保留貼壁細胞傳代，觀察，測試在培養(yǎng)液中添加地塞米松（Dex）10<-18>mol/L，β-甘油磷酸鈉（β-GP）10mmol/L，抗壞血酸（AA）50~ug/ml條件下誘導犬MSC體外分化為成骨細胞，利用倒置光學顯微鏡，透射電鏡，四甲基偶氮鹽（MTT）比色，堿性磷酸酶（ALP）活性，骨鈣素（OCN）含量測定等方法研究骨髓間充質干細胞的增殖和分化情況。 4．

7、在前述骨髓間充質干細胞優(yōu)化及AW多孔支架復合材料制各和性能研究基礎上，進行了成骨誘導犬自體MSCs／AW多孔支架材料復合體體外構建，修復實驗性節(jié)段性骨缺損，X光片觀察復合材料在體內骨缺損處的結合情況，探討其骨缺損修復能力。該部分實驗還在進行中。 結果 1．AW多孔支架復合材料具有良好的生物相容性；硬脂酸加入量為30wt％、粒徑為20～30目的AW多孔支架材料其孔隙率達67％，孔徑600～850μm，抗壓強度達15.3MP

8、a，其更有利于細胞的生長和成骨功能的表達 2．裸鼠肌袋異位誘導成骨實驗顯示：與單純的支架材料以及骨髓間充質干細胞材料復合物相比，成骨誘導后的rMSCs與材料復合后制備的新型生物復合材料在裸鼠肌袋內具有更強的骨誘導和異位成骨能力，提示其具有良好的成骨潛能，作為新型骨組織工程生物復合材料。而rMSCs在裸鼠肌袋內具多向分化潛能，是否能作為骨組織工程種子細胞尚待商榷。 3．形態(tài)學觀察表明，犬骨髓間充質干細胞（canine me

9、senchymal stemcells，cMSCs）貼壁細胞呈集落生長，有成纖維細胞樣外觀，透射電鏡可見成骨誘導后cMSCs具有分泌型細胞的特征；推測成骨誘導劑可促進骨髓間充質干細胞向成骨方向分化，表現(xiàn)為ALP活性、OCN含量明顯升高。本實驗表明所培養(yǎng)的cMSCs保持了未分化狀態(tài)，并在成骨誘導劑的作用下可向成骨細胞分化。 4．該實驗尚未完成，其X光片結果初步顯示成骨誘導后MSCs／AW支架材料在體內骨愈合情況較好。其成骨作用有待