鞘內(nèi)注射甘珀酸對腰5脊神經(jīng)切斷大鼠雙側(cè)痛覺高敏的影響及機制研究.pdf

1、神經(jīng)病理性疼痛(neuropathicpain，NP)是由于外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)的直接損傷和功能紊亂引起的疼痛。NP在人群發(fā)生率超過1％，常表現(xiàn)為:自發(fā)性疼痛(Spontaneouspain)、痛覺高敏(Hyperalgesia)、異常疼痛(Allodynia)和感覺異常(Paresthesia)，嚴重干擾了患者的生活，是一種常見的慢性疾患。除了損傷側(cè)的疼痛不適，在NP的研究中，經(jīng)常觀察到軀體一側(cè)神經(jīng)損傷后，身體對側(cè)相應部位也出現(xiàn)自發(fā)性疼

2、痛或痛敏，即雙側(cè)痛覺高敏現(xiàn)象。
　　 雙側(cè)痛覺高敏產(chǎn)生的外周和中樞機制一直是近來疼痛研究的熱點之一，其發(fā)生可能涉及很多通路。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)細胞（尤其是星形膠質(zhì)細胞）主導的神經(jīng)炎癥和神經(jīng)免疫反應在雙側(cè)痛覺高敏的發(fā)生和維持中發(fā)揮重要作用。星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細胞的主要組成部分，在NP的大鼠脊髓中，可見星形膠質(zhì)細胞的長期（＞5個月）活化，鞘內(nèi)注射星形膠質(zhì)細胞抑制劑氟代檸檬酸能明顯逆轉(zhuǎn)NP，而鞘內(nèi)注射小膠質(zhì)細胞

3、抑制劑米諾環(huán)素時對NP的影響不大，因此活化的星形膠質(zhì)細胞在NP中的重要作用被廣泛接受。然而星形膠質(zhì)細胞參與NP的機制目前仍不清楚，有學者提出星形膠質(zhì)細胞之間廣泛的縫隙連接可能參與了NP時星形膠質(zhì)細胞的活化，因此進一步深入探討縫隙連接參與星形膠質(zhì)細胞的活化機制，有助于進一步闡明NP的發(fā)生機制。
　　 縫隙連接（gapjunction，GJ）是由縫隙連接蛋白(connexin,Cx)組成的跨膜蛋白通道結(jié)構(gòu)，是細胞之間唯一能直接進行物

4、質(zhì)和信息交換的通道，其主要作用是緩沖離子濃度、形成電突觸和參與信號傳遞。在外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，一些神經(jīng)元和幾乎所有的星形膠質(zhì)細胞都能夠表達Cx，小膠質(zhì)細胞則不表達，神經(jīng)元之間的GJ相對較少，而膠質(zhì)細胞（主要是星形膠質(zhì)細胞）的GJ數(shù)量遠遠大于神經(jīng)元，而且大多數(shù)的星形膠質(zhì)細胞通過GJ廣泛偶聯(lián)，形成一種星形膠質(zhì)細胞網(wǎng)絡(luò)。當星形膠質(zhì)細胞被傷害性信號激活后，細胞內(nèi)的Ca2+濃度會迅速升高，可使GJ處的電壓門控通道開放，使傷害性信號傳導到鄰近的星形

5、膠質(zhì)細胞內(nèi)，導致鄰近的星形膠質(zhì)細胞也被激活，這種現(xiàn)象被稱為鈣震蕩或鈣波。這種鈣波可促使星形膠質(zhì)細胞合成并釋放ATP，后者可與神經(jīng)元細胞膜上的ATP受體結(jié)合，進而促使神經(jīng)元上的離子變化，產(chǎn)生谷氨酸，導致疼痛的維持。因此有學者提出，慢性疼痛時傷害性刺激信號可誘導星形膠質(zhì)細胞內(nèi)的鈣離子移動，并可通過GJ網(wǎng)絡(luò)以鈣波形式在星形膠質(zhì)細胞網(wǎng)絡(luò)中傳遞，從而引起星形膠質(zhì)細胞的廣泛活化，產(chǎn)生大量的活性因子，最終導致NP時雙側(cè)痛覺高敏的產(chǎn)生，但這個觀點目前還

6、未得到大量研究的證實。
　　 關(guān)于活化的星形膠質(zhì)細胞釋放的活性因子，既往研究提示主要包括下列因子如:趨化因子、前列腺素、炎性細胞因子等，其中炎性細胞因子中的腫瘤壞死因子-α(turmornecrosisfactor-α，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)，可直接或間接的作用于神經(jīng)元表面的受體，或作用于其他免疫細胞，調(diào)節(jié)其它炎性因子的合成和釋放，參與NP的發(fā)生和維持。Dong-hoYoun等發(fā)現(xiàn)

7、鞘內(nèi)注射TNF-α能誘導大鼠的痛覺高敏，PinhuiMiao等人也觀察到PNI模型大鼠術(shù)后TNF-α的表達持續(xù)高水平，并且主要分布在星形膠質(zhì)細胞，外周或鞘內(nèi)注射TNF-α抗體能緩解動物的雙側(cè)痛覺高敏，可見TNF-α在雙側(cè)痛覺高敏中起了重要的作用。在爪、坐骨神經(jīng)鞘、脊髓和多個腦區(qū)內(nèi)注射IL-1β后，均能導致動物痛覺高敏的出現(xiàn)，外周或鞘內(nèi)注射IL-1β抗體能緩解動物的痛覺高敏，這均表明IL-1β參與大鼠痛覺高敏的產(chǎn)生。炎性細胞因子的致痛作用

8、可能與其直接促進痛覺纖維釋放降鈣素基因相關(guān)肽、P物質(zhì)及興奮傷害性神經(jīng)元有關(guān)，還可能通過旁分泌和自分泌作用促進一氧化氮、緩激肽、前列腺素及炎性因子釋放或敏化痛覺纖維，這些物質(zhì)還能增加初級傳入神經(jīng)末梢痛遞質(zhì)的釋放和增加痛覺傳遞神經(jīng)元的興奮性來擴大痛覺傳遞，
　　 NP有多種動物模型，并且在多個模型中如:坐骨神經(jīng)炎癥模型，慢性坐骨神經(jīng)束扎模型以及腰5脊神經(jīng)切斷模型等均可出現(xiàn)雙側(cè)痛覺高敏。腰5脊神經(jīng)切斷模型是我實驗室經(jīng)常應用的模型，單側(cè)

9、腰5脊神經(jīng)切斷后，損傷側(cè)后肢在術(shù)后1天就出現(xiàn)痛覺高敏且持續(xù)至少4個月，而在手術(shù)后10天對側(cè)后肢即可觀察到明顯的機械痛敏，對側(cè)后肢痛覺過敏的強度比損傷側(cè)稍低且出現(xiàn)的時間晚，這與臨床上一些慢性疼痛病人主訴的對側(cè)疼痛的癥狀相似。
　　 本研究我們采用大鼠腰5脊神經(jīng)切斷(L5spinalnervetransection,SNT)模型，觀察鞘內(nèi)注射甘珀酸(earbenoxolone，CBX)，一個廣泛使用的GJ阻斷劑，對大鼠雙側(cè)機械痛覺高

10、敏的影響，同時觀察脊髓背角星形膠質(zhì)細胞標志物（glialfibrillaryacidicprotein，GFAP）和炎性細胞因子TNF-α和IL-1β表達的變化，探討CBX對大鼠雙側(cè)機械痛覺高敏的影響及可能機制。
　　 目的:
　　 觀察鞘內(nèi)注射不同劑量CBX對SNT大鼠雙側(cè)機械痛閾的影響，同時采用免疫組化的方法觀察雙側(cè)脊髓背角GFAP的表達變化，ELSIA法測定雙側(cè)炎性細胞因子TNF-α、IL-1β表達水平的變化。旨在

11、探討GJ、星形膠質(zhì)細胞及炎性細胞因子在NP時雙側(cè)痛覺高敏發(fā)生中的可能作用。
　　 方法:
　　 60只成年雄性SD大鼠，隨機分成五組(n=12):Ⅰ.假手術(shù)組(Sham+NS),Ⅱ.模型組(SNT+NS)，Ⅲ.SNT+CBX(0.05μg),Ⅳ.SNT+CBX(0.5μg),V.SNT+CBX(5μg)。Ⅰ組僅暴露腰5脊神經(jīng)，不切斷，Ⅱ至Ⅴ組根據(jù)Kim和Chung創(chuàng)建的方法制作SNT模型，2％的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠

12、后，常規(guī)消毒，俯臥捆綁，腹下墊墊，充分腹曲，沿L4-6脊柱中線切皮，鈍性分離脊柱左側(cè)肌肉組織，切橫突，暴露腰5脊神經(jīng)，用3-0的絲線結(jié)扎并切斷左側(cè)腰5脊神經(jīng)。在術(shù)后10天，Ⅰ組和Ⅱ組鞘內(nèi)注射生理鹽水10μl，Ⅲ至Ⅴ組鞘內(nèi)注射CBX0.05μg（10μl）、0.5μg(10μl)和5μg(10μl)，分別于術(shù)前1d，術(shù)后1d、3d、5d、7d、10d及給藥后1h、2h、4h、6h每組隨機取6只大鼠測雙側(cè)機械痛閾(MWT)。鞘內(nèi)給藥2h后每

13、組隨機取3只大鼠的腰段脊髓，采用免疫組化技術(shù)觀察雙側(cè)脊髓背角GFAP的表達。另取3只大鼠的腰段脊髓采用ELISA的方法測定雙側(cè)脊髓背角TNF-α和IL-1β表達水平。
　　 采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，定量資料以例數(shù)、均數(shù)±標準差((-x)±s)表示。各獨立組間比較采用單因素方差分析(One-WayANOVA)，組間均數(shù)兩兩比較，若方差齊同時采用LSD檢驗，方差不齊則采用Dunnett'sT3檢驗。重復測量數(shù)據(jù)采用多組

14、單因素重復測量數(shù)據(jù)的方差分析，判斷組別和時間點的主效應以及組別和時間點之間的交互效應，若滿足球形假設(shè)則采用SphericityAssumed檢驗，不滿足球形假設(shè)則采用Greenhouse-Geisser檢驗，各處理組間比較采用單因素方差分析(One-WayANOVA)，各時間點間比較采用單個重復測量因素的方差分析。P≤0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果:
　　 MWT的測定結(jié)果
　　 1.五組大鼠術(shù)前1d

15、雙側(cè)MWT均無明顯差異（P＞0.05）;與術(shù)前相比，Ⅰ組術(shù)后各時間點雙側(cè)MWT無明顯差異(P＞0.05);Ⅱ至Ⅴ組損傷側(cè)術(shù)后1dMWT即開始下降(P＜0.05)，術(shù)后5至10dMWT明顯降低(P＜0.05);與術(shù)后10d給藥前1h相比，Ⅱ和Ⅲ組給藥后1、2、4、6h雙側(cè)MWT均無明顯差異(P＞0.05);Ⅳ組給藥后1、2、4、6h損傷側(cè)MWT均無明顯差異(P＞0.05)，而對側(cè)給藥后1hMWT即開始提高（P＜0.05），2h時MWT提高

16、的最明顯(P＜0.05)，4h時MWT開始下降但仍高于給藥前（P＜0.05），6h后MWT與給藥前無明顯差異（P＞0.05）;Ⅴ組給藥后1、2、4h雙側(cè)MWT明顯提高（P＜0.05），6h后無明顯差異(P＞0.05).
　　 2.脊髓背角GFAP的測定結(jié)果
　　 免疫組化的結(jié)果顯示，Ⅱ和Ⅲ組雙側(cè)脊髓背GFAP的染色較Ⅰ組明顯增強;Ⅳ組損傷側(cè)脊髓背角GFAP的染色較Ⅰ組損傷側(cè)明顯增強，較Ⅱ組損傷側(cè)則無明顯變化，而對側(cè)脊髓背

17、角GFAP的染色較Ⅱ組對側(cè)明顯減弱;Ⅴ組雙側(cè)脊髓背角GFAP的染色較Ⅱ組明顯減弱。GFAP陽性細胞數(shù)的比較，Ⅱ和Ⅲ組雙側(cè)脊髓背角GFAP的陽性細胞數(shù)較Ⅰ組明顯增多（P＜0.05）;Ⅳ組損傷側(cè)脊髓背角GFAP的陽性細胞數(shù)較Ⅰ組損傷側(cè)明顯增多(P＜0.05)，較Ⅱ組損傷側(cè)則無明顯變化(P＞0.05)而對側(cè)脊髓背角GFAP的陽性細胞數(shù)較Ⅱ組對側(cè)明顯減少（P＜0.05）;Ⅴ組雙側(cè)脊髓背角GFAP陽性細胞數(shù)較Ⅱ組均明顯降低(P＜0.05)。

18、>　　 3.脊髓背角TNF-α和IL-1β的水平
　　 ELISA的測定結(jié)果顯示，與Ⅰ組相比，Ⅱ和Ⅲ組雙側(cè)脊髓背角TNF-α和IL-1β的水平均明顯提高(P＜0.05);與Ⅱ組相比，Ⅳ組損傷側(cè)脊髓背角TNF-α和IL-1β的水平無明顯變化，而對側(cè)脊髓背角TNF-α和IL-1β的水平明顯降低（P＜0.05）;與Ⅱ組相比，Ⅴ組雙側(cè)脊髓背角TNF-α和IL-1β的水平明顯降低（P＜0.05）。
　　 結(jié)論:
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