鞘內(nèi)注射甘珀酸對糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠疼痛閾值及縫隙連接蛋白43表達(dá)的影響.pdf

1、研究背景與目的：
　　糖尿病(diabetes mellitus，DM)已經(jīng)成為21世紀(jì)全球最大衛(wèi)生保健問題之一，是一種由多種病因引發(fā)的一種慢性代謝異常綜合征。糖尿病神經(jīng)病，而最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一就是糖尿病神經(jīng)病理性疼痛（Diabetic Neuropathic Pain，DNP）。DNP易引起痛覺過敏痛覺超敏以及自發(fā)痛等能導(dǎo)顯著降低生活質(zhì)量的并發(fā)癥。目前，DNP的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且具體機(jī)制尚不詳。近來的研究發(fā)現(xiàn)DNP模型伴隨著脊髓星形

2、膠質(zhì)細(xì)胞（astrocyte）的激活，而且抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活能夠減輕DNP大鼠的機(jī)械性痛敏。在外周神經(jīng)病變后，脊髓背角的感覺神經(jīng)元興奮性加強(qiáng)，成為傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)痛覺的重要位點(diǎn)。而背角感覺神經(jīng)元周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)元興奮性增強(qiáng)，痛覺敏感傳遞增強(qiáng)，尤其是在神經(jīng)病理性疼痛（Neuropathic Pain，NP）的維持中也起到重要作用。同樣，外周神經(jīng)神經(jīng)病變時(shí)，背根神經(jīng)節(jié)（Dorsal Root Ganglion，DRG）同樣可發(fā)現(xiàn)衛(wèi)星膠

3、質(zhì)細(xì)胞（satallite glialcells，SGCs）的激活。
　　星型膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central Nervous System，CNS)中數(shù)目最多的細(xì)胞類型，歷來都被認(rèn)為是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中對神經(jīng)元起支持作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元之間解剖關(guān)系緊密，兩者之間的互相作用是形成NP的重要機(jī)制。星型膠質(zhì)細(xì)胞之間通過膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)元的激活形成快速電反應(yīng)。周圍神經(jīng)病變后星形膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)被激活，縫隙連接（gap junction

4、，GJ）互相連接，組成功能合胞體，形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成細(xì)胞之間的鈣離子波動(dòng)，從而使星形膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)為增殖、肥大，在脊髓背角可見。神經(jīng)損傷相關(guān)的星形膠質(zhì)細(xì)胞激活與行為學(xué)痛覺敏感相關(guān)，而抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活性可以減輕痛覺敏感。
　　膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glialfibrillary acidic proteins，GFAP)主要分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞，在各種慢性疼痛模型中免疫組化染色GFAP后可在脊髓背角清晰的見到肥大增生的星形

5、膠質(zhì)細(xì)胞。DRG中的SGCs也特異表達(dá)GFAP。
　　GJ是細(xì)胞間的一種特殊蛋白質(zhì)連接通道，負(fù)責(zé)細(xì)胞間大小在1kDa以內(nèi)小分子物質(zhì)的快速交換，如離子，細(xì)胞信號分子，代謝物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)等。普遍存在于實(shí)質(zhì)性臟器組織中。Cx處于動(dòng)態(tài)變化過程中，對縫隙連接通道的調(diào)節(jié)，如磷酸化，可以改變GJ通道的通透性和對通透物質(zhì)的選擇性，進(jìn)而影響細(xì)胞之間的物質(zhì)交換和信號傳遞而導(dǎo)致細(xì)胞功能異常。Cx43是特異性表達(dá)在星形膠質(zhì)細(xì)胞上的一種Cx。有文獻(xiàn)表明在D

6、NP大鼠上脊髓組織上星形膠質(zhì)細(xì)胞的Cx43生成增高，神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞之間的GJ溝通功能加強(qiáng)。但脊髓膠質(zhì)細(xì)胞間的GJ在維持DNP中的具體機(jī)制并不清楚，尤其是特異性表達(dá)在星形膠質(zhì)細(xì)胞之間的Cx43在DNP的具體機(jī)制。DRG中的神經(jīng)元為假單極神經(jīng)細(xì)胞，是軀體和內(nèi)臟感覺傳入神經(jīng)纖維的初級神經(jīng)元。有較多的文獻(xiàn)證明，DRG在感覺神經(jīng)受損后電活動(dòng)和神經(jīng)元形態(tài)等發(fā)生變化而產(chǎn)生NP。DRG中衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞間的GJ也參與NP的發(fā)生，但在DNP上如何變化尚未見

7、文獻(xiàn)報(bào)道。
　　GJ阻斷劑甘珀酸(Carbenoxolone，CBX），18-甘草次酸的衍生物，是被研究最多的阻斷劑。它能阻礙由于神經(jīng)損傷而引起的縫隙連接偶合，減輕由神經(jīng)損傷引起的神經(jīng)病理性疼痛行為，在慢性疼痛的多種動(dòng)物模型中產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用，目前，有關(guān)連續(xù)鞘內(nèi)注射不同劑量CBX對DNP大鼠痛覺反應(yīng)的影響及與脊髓背角和DRG中Cx43表達(dá)的關(guān)系的研究未見報(bào)道。因而，本研究擬建立DNP大鼠模型，采用連續(xù)鞘內(nèi)注射CBX的方法，觀察不同劑量

8、CBX對糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠痛覺反應(yīng)及Cx43表達(dá)的量效和時(shí)效關(guān)系，探討CBX對DNP的治療作用及可能鎮(zhèn)痛機(jī)制，為開展臨床研究及疼痛治療提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　清潔級雄性SD大鼠60只，8-10周齡，體重180～220 g，由廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。造模前12小時(shí)禁食不禁飲。于造模當(dāng)天用天平稱大鼠體重，尾靜脈取血測空腹血糖值。將STZ按照2％濃度加入檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中（PH4.2，0.01mmol/L），現(xiàn)

9、配現(xiàn)用，溶解過程注意無菌。隨機(jī)選取40只SD大鼠，用2%STZ以60mg/kg腹腔注射。30分鐘內(nèi)注射完畢。14天后，選取血糖值大于300mg/dL，且雙側(cè)后足50%機(jī)械縮足閾值（50%paw withdraw threshold，PWT）小于4g者為DNP大鼠成功模型。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中每3天測一次隨機(jī)血糖，血糖值<16.7mmol/L的大鼠予以剔除，以免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。從對照組大鼠中隨機(jī)選取24只，分為C-C組（n=18，各選6只大鼠鞘

10、內(nèi)分別注射甘珀酸10u、25ug、50ug，注射容量均為10ul）；C組（n=6，大鼠鞘內(nèi)注射等容量的滅菌PBS溶液）。從DNP模型大鼠中隨即選取24只，分為D-C組（n=18，各選6只DNP大鼠鞘內(nèi)分別注射甘珀酸10ug、25ug、50ug，注射容量均為10ul）；D組（n=6， DNP大鼠鞘內(nèi)注射等容量滅菌PBS溶液；分別測定大鼠造模前、造模后14天測機(jī)械痛閾、每次鞘內(nèi)注射前、每次鞘內(nèi)注射后1h、3h、6h的機(jī)械痛閾。采用weste

11、rn blot等檢測技術(shù)觀察脊髓背角和DRG中Cx43、GFAP表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.造模后大鼠生理和活動(dòng)的改變
　　造模前測四組大鼠基礎(chǔ)空腹血糖值無顯著差異（P＞0.05），接受腹腔注射檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液后，無多食多飲等糖尿病癥狀，尿量正常，毛發(fā)柔順，體重正常，兩周后血糖值較接受腹腔注射前的基礎(chǔ)血糖值無明顯變化（P＞0.05）；而D-C組和D組即逐漸表現(xiàn)出糖尿病癥狀：表現(xiàn)出不同程度的多食、多飲、多尿，體重減

12、輕，毛發(fā)稀少，毛色暗淡，性格暴躁，兩周后測血糖值顯著升高（P＜0.05）。
　　2.機(jī)械疼痛閾值的變化
　　2.1.造模前后各組大鼠機(jī)械疼痛閾值變化造模前四組大鼠的基礎(chǔ)50%PWT差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。C組和C-C組腹腔注射14天后的50%PWT較各自基礎(chǔ)50%PWT差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。D-C組與D組腹腔注射STZ14天后的50%PWT較基礎(chǔ)50%PWT均顯著降低（P＜0.05），兩組間比較差無統(tǒng)計(jì)

13、學(xué)意義（P＞0.05）；與C-C組及C組比較，D-C組與D組腹腔注射STZ14天后的50%PWT均明顯降低（P＜0.05）。
　　2.2.各組大鼠第一天鞘內(nèi)注藥后不同時(shí)間點(diǎn)痛閾值變化 C組鞘內(nèi)注藥后各時(shí)間點(diǎn)未見明顯變化（P＞0.05）。C-C組鞘內(nèi)注射后1h、6h各時(shí)間點(diǎn)%PWT與造模前%PWT比較無明顯變化（P＞0.05），但C-C組中在鞘內(nèi)注射CBX(10ug、25ug、50ug)后3h的%PWT均較C組降低（P＜0.05)。

14、D-C組鞘內(nèi)注射CBX(10ug、25ug、50ug)1h、3h、6h后與給藥前%PWT對比呈劑量依賴性增加（P＜0.05）；與D組比較，D-C組在1h、3h、6h的%PWT均升高（P＜0.05）。
　　2.3.各組大鼠鞘內(nèi)注藥不同天數(shù)不同時(shí)間點(diǎn)痛閾值變化 D-C組后一天給藥后1h、3h、6h的%PWT較前一天同時(shí)間點(diǎn)的%PWT都明顯增高(P＜0.05)，表現(xiàn)出明顯的時(shí)間累加效應(yīng)。另外，C-C組每次給藥后%PWT都明顯降低(P＜0

15、.05)，在第三天表現(xiàn)最明顯，第五天恢復(fù)正常。
　　3．脊髓背角Cx43和GFAP蛋白的表達(dá)水平比較
　　四組均有Cx43和GFAP蛋白表達(dá)。與C組比較，D組Cx43和GFAP表達(dá)明顯增加（P＜0.05）。與D組比較，D-C組在連續(xù)5天鞘內(nèi)注射CBX后，Cx43、GFAP表達(dá)呈劑量依賴性降低（P＜0.05）。與C組比較，C-C組在連續(xù)5天鞘內(nèi)注射CBX后Cx43和GFAP表達(dá)無明顯變化（P＞0.05），而且不同劑量組間比較也

16、無明顯差異（P＞0.05）
　　4．背根神經(jīng)節(jié)Cx43和GFAP蛋白的表達(dá)水平比較
　　四組均有Cx43和GFAP蛋白表達(dá)。與C組比較，D組Cx43和GFAP表達(dá)明顯增加（P＜0.05）。與D組比較，D-C組在連續(xù)5天鞘內(nèi)注射CBX后，Cx43、GFAP表達(dá)呈劑量依賴性降低（P＜0.05）。與C組比較，C-C組在連續(xù)5天鞘內(nèi)注射CBX后Cx43和GFAP表達(dá)有下降，但不明顯（P＞0.05），而且不同劑量組間比較也無明顯差異（

17、P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.鞘內(nèi)注射不同劑量甘珀酸，可劑量依賴性增加糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠的機(jī)械痛閾，且鎮(zhèn)痛效果有累積效應(yīng)。
　　2.糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓背角和背根神經(jīng)節(jié)Cx43、GFAP蛋白表達(dá)明顯增加，提示高表達(dá)Cx43、GFAP蛋白的星型膠質(zhì)細(xì)胞和衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞可能被激活，并參與糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和維持。
　　3.鞘內(nèi)注射甘珀酸可劑量依賴性下調(diào)Cx43蛋白表達(dá)，提示糖尿病神經(jīng)病理性