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文檔簡(jiǎn)介
1、本文對(duì)鞘內(nèi)注射間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)大鼠神經(jīng)病理性疼痛的作用及機(jī)制進(jìn)行了研究。本研究分為三個(gè)部分:
第一部分:人臍帶Wharton’s jelly來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定。
目的:從臍帶Wharton’s jelly中分離、培養(yǎng)得到性狀穩(wěn)定的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,流式細(xì)胞技術(shù)鑒定所獲取的傳代細(xì)胞,CCK-8法和流式細(xì)胞技術(shù)共同測(cè)定細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞周期,用于后續(xù)試驗(yàn)。
方法:從協(xié)和醫(yī)院收集健康產(chǎn)婦足月剖宮產(chǎn)
2、術(shù)后新生兒的臍帶,通過(guò)組織塊培養(yǎng)法從臍帶Wharton’s jelly中分離得到臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,酶消化法傳代。CCK-8法和流式細(xì)胞技術(shù)共同測(cè)定第三代細(xì)胞(P3)的增殖能力和細(xì)胞周期,取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的P3代培養(yǎng)細(xì)胞應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞特異性表型CD73, CD90, CD105的表達(dá)和一些造血細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白 CD45, CD34, CD11b, CD19和人類白細(xì)胞抗原II(HLA-DR)的表達(dá)情況。
結(jié)果:用組
3、織塊培養(yǎng)法從臍帶Wharton’s jelly中分離得到的P3代培養(yǎng)細(xì)胞高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞特異性表型CD73(94.45±2.14%), CD90(95.58±1.78%)和 CD105(95.62±1.62%),而低表達(dá)或者不表達(dá)造血細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白CD34(0.49±0.19%), CD45(1.87±0.68%), CD19(0.33±0.11%), CD11b(0.10±0.03%)和HLA-DR(0.18±0.07%),據(jù)此認(rèn)
4、為臍帶分離得到的貼壁細(xì)胞屬于間充質(zhì)干細(xì)胞;CCK-8檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)細(xì)胞前24h內(nèi)增殖不明顯,2到3天后進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期并持續(xù)到第5到6天,然后到達(dá)生長(zhǎng)平臺(tái)期;流式技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)處于G0/G1細(xì)胞為75.1%、S期細(xì)胞為16.3%、G2/M細(xì)胞為8.6%,表明24.9%的細(xì)胞處于增殖狀態(tài),增殖能力比較旺盛。
結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)成功的通過(guò)組織塊培養(yǎng)法從臍帶中分離培養(yǎng)得到間充質(zhì)干細(xì)胞,該細(xì)胞具有性狀穩(wěn)定,增殖速度快的特點(diǎn)。
5、> 第二部分:鞘內(nèi)注射間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)大鼠神經(jīng)病理性疼痛的治療作用。
目的:采用L5脊神經(jīng)結(jié)扎(spinal nerve ligation,SNL)的方法建立大鼠神經(jīng)病理性疼痛動(dòng)物模型,經(jīng)鞘內(nèi)注射臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,HUC-MSCs),檢測(cè)其在大鼠脊髓能存活、分布情況以及對(duì)大鼠神經(jīng)病理性疼痛癥狀的改善作用。
方
6、法:SPF級(jí)雄性SD大鼠40只隨機(jī)分成4組,每組10只:(1)對(duì)照組(Sham組):僅暴露左側(cè)L5脊神經(jīng),不結(jié)扎;鞘內(nèi)置管;動(dòng)物疼痛模型成功后第三天蛛網(wǎng)膜下腔注射注射無(wú)菌PBS20ul;(2)空白組(SNL組):結(jié)扎左側(cè)L5脊神經(jīng);鞘內(nèi)置管;動(dòng)物疼痛模型成功后鞘內(nèi)不給予注射;(3)模型組(SNL+PBS組):結(jié)扎左側(cè)L5脊神經(jīng);鞘內(nèi)置管;動(dòng)物疼痛模型成功后第三天蛛網(wǎng)膜下腔注射注射無(wú)菌PBS20ul;(4)治療組(SNL+HUC-MSC組
7、):結(jié)扎L5脊神經(jīng),動(dòng)物模型成功后第三天蛛網(wǎng)膜下腔注射間充質(zhì)干細(xì)胞1x106個(gè)(重懸在20ul無(wú)菌PBS中)。于大鼠脊神經(jīng)結(jié)扎模型后的第1,2,3,5,7,9,11,14天檢測(cè)各組大鼠同側(cè)的熱刺激縮足反射潛伏期(paw withdrawal thermal latency,PWTL)和機(jī)械刺激撤足閾值(paw withdrawal mechanical threshold, PWMT);治療組大鼠在造模后第7天隨機(jī)取3只處死取脊髓腰膨大
8、段檢測(cè)抗人細(xì)胞核抗體(anti-human nuclei monoclonal antibody),以追蹤移植的HUC-MSCs的存活和分布情況。
結(jié)果:行為學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與Sham組相比,SNL組在造模后第一天出現(xiàn)了明顯的PWMT和 PWTL下降,并且第三天下降到最低并以此狀態(tài)持續(xù)到14天。造模后第三天鞘內(nèi)注射HUC-MSCs,PWMT從造模后第7天(注射后第4天)開(kāi)始增加并持續(xù)到造模后14天;PWTL的趨勢(shì)和PWMT相似,增
9、加從造模后的第5天(注射后第2天)出現(xiàn)并且持續(xù)到造模后14天。免疫熒光發(fā)現(xiàn)在大鼠腰膨大段脊髓中檢測(cè)到抗人細(xì)胞核抗體的表達(dá),主要分布在左側(cè)脊髓背角。
結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)通過(guò)L5-SNL成功建立了大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型;HUC-MSCs鞘內(nèi)注射后,能在脊髓內(nèi)存活和遷移到脊髓背角內(nèi);鞘內(nèi)注射HUC-MSCs能夠明顯改善SNL大鼠的疼痛癥狀。
第三部分:鞘內(nèi)注射間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)大鼠神經(jīng)病理性疼痛治療作用的機(jī)制研究。
目的:
10、研究HUC-MSCs對(duì)SNL大鼠神疼痛癥狀治療作用的機(jī)制。
方法:SPF級(jí)雄性SD大鼠30只隨機(jī)分成3組,每組10只:(1)對(duì)照組(Sham組):僅暴露左側(cè)L5脊神經(jīng),不結(jié)扎;鞘內(nèi)置管;動(dòng)物疼痛模型成功后第三天蛛網(wǎng)膜下腔注射注射無(wú)菌PBS20ul;(2)模型組(SNL+PBS組):結(jié)扎左側(cè)L5脊神經(jīng);鞘內(nèi)置管;動(dòng)物模型成功后第三天蛛網(wǎng)膜下腔注射注射無(wú)菌PBS20ul;(3)治療組(SNL+HUC-MSC組)結(jié)扎L5脊神經(jīng),動(dòng)物
11、模型成功后第三天蛛網(wǎng)膜下腔注射間充質(zhì)干細(xì)胞1x106個(gè)(重懸在20ul無(wú)菌PBS中)。各組大鼠在造模后14天處死取材檢測(cè)。EILSA方法檢測(cè)左側(cè)脊髓背角中的炎癥因子 IL-1β, IL-17A和 IL-10和血清中炎癥因子IL-1β,IL-17A的表達(dá)水平;Western blot檢測(cè)脊髓背角中BDNF蛋白的相對(duì)含量;免疫熒光和Western blot檢測(cè)左側(cè)脊髓背角里激活的的星型膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP和小膠質(zhì)細(xì)胞激活標(biāo)志物IBA-1的
12、表達(dá)情況。
結(jié)果:與Sham組相比,ELISA結(jié)果表明SNL大鼠左側(cè)脊髓背角的促炎癥因子IL-1β和IL-17A明顯增加,抗炎因子IL-10并未發(fā)現(xiàn)明顯的改變;Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)BDNF的蛋白合成增加;免疫熒光可以看到 SNL大鼠背角中的星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞明顯激活,表現(xiàn)為GFAP和IBA-1陽(yáng)性標(biāo)志的細(xì)胞數(shù)量增多,Western blot檢測(cè)結(jié)果與免疫熒光結(jié)果一致, GFAP蛋白和 IBA-1蛋白量明顯增加
13、。鞘內(nèi)給予HUC-MSCs治療后,與SNL組相比,促炎因子IL-1β和IL-17A顯著減少,同時(shí)增加促炎因子IL-10的水平;免疫熒光觀測(cè)到左側(cè)脊髓背角的GFAP陽(yáng)性的細(xì)胞和IBA-1陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量減少,Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)GFAP蛋白和IBA-1蛋白量顯著減少。造模后第14天血清的IL-1β和 IL-17A在 Sham組、SNL組、SNL+HUC-MSC沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)論:HUC-MSCs對(duì)SNL大鼠疼痛起著
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