聚酰胺-胺型樹狀大分子介導(dǎo)基因傳遞的研究.pdf

1、基因治療成功的關(guān)鍵是需要高效/安全和靶向的載體系統(tǒng)，將DNA轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。聚酰胺-胺型樹狀大分子（PAMAM）是一類納米級的聚合物分子，具有高度支化的球形結(jié)構(gòu)，分子內(nèi)含有大量的伯胺和叔胺基團(tuán)，能與DNA自組裝形成帶正電荷的緊湊復(fù)合物，將DNA輸送至多種類型的細(xì)胞中。在本論文中，我們對DNA和PAMAM的相互作用及其動(dòng)力學(xué)過程進(jìn)行了系統(tǒng)的表征，并研究聚丙交酯乙交酯（PLGA）/聚乳酸（PLA）和陽離子脂質(zhì)體與PAMAM和DNA

2、復(fù)合物的組裝行為及其對轉(zhuǎn)染效率的影響。完成的工作包括以下幾個(gè)方面： （1）通過瓊脂糖凝膠電泳/[Ru(phen)2dppz]2+置換和排除實(shí)驗(yàn)/粒徑和電位測試考察PAMAM與DNA的相互作用，圓二色譜（CD）和傅立葉紅外光譜（FTIR）研究二者組裝過程中DNA構(gòu)象的變化。結(jié)果表明，PAMAM與DNA在N、P比大于1.5時(shí)形成了穩(wěn)定且?guī)д姾傻膹?fù)合物，平均粒徑在150-180 nm范圍內(nèi)。與裸質(zhì)粒相比，DNA與PAMAM復(fù)合后27

3、0 nm處CD信號強(qiáng)度減弱，峰位置發(fā)生紅移；增加溶液離子強(qiáng)度/過低或過高的Ph值都會引起CD信號的降低，說明DNA螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。FTIR光譜研究表明復(fù)合狀態(tài)的質(zhì)粒DNA仍保留其典型的B型構(gòu)象，只是其堿基堆積作用受到了強(qiáng)烈的擾動(dòng)。 （2）應(yīng)用熒光停流技術(shù)研究DNA與PAMAM相互作用的動(dòng)力學(xué)，包括兩者的復(fù)合過程及其逆過程（即DNA從復(fù)合物中的解離）。結(jié)果表明DNA的壓縮是復(fù)合過程的速率決定步驟，而DNA的伸展和去折疊是解離過

4、程的速率決定步驟。在較低的N、P比時(shí)，形成的PAMAM、DNA復(fù)合物是松散的，可在一定程度內(nèi)發(fā)生解離。而在N、P比達(dá)到2.0以上后，DNA在PAMAM的作用下被完全壓縮，復(fù)合物處于熱力學(xué)最穩(wěn)定的狀態(tài)，解離變得越來越困難。 （3）采用乳化-分散-蒸發(fā)方法制備了含PAMAM的PLGA納米粒，并與DNA復(fù)合。通過瓊脂糖凝膠電泳/熒光置換/粒徑和電位測試表征復(fù)合物的形成，核酸酶酶切實(shí)驗(yàn)考察復(fù)合物對DNA的保護(hù)作用，噻唑藍(lán)（MTT）方法研

5、究復(fù)合物的細(xì)胞毒性，同時(shí)應(yīng)用體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)研究復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果表明DNA與陽離子納米粒在N、P比2以上形成了穩(wěn)定/緊湊的復(fù)合物。復(fù)合物的zeta電位在低N、P比時(shí)為負(fù)值，隨N、P比的增加而增加，并在N、P比2以上時(shí)變?yōu)檎怠Ｃ盖袑?shí)驗(yàn)表明復(fù)合物能保護(hù)DNA抵御酶的降解作用。復(fù)合物的細(xì)胞毒性較小，對HepG2和NIH-3T3細(xì)胞的生長狀態(tài)沒有太大的影響。在無血清介質(zhì)中，DNA與陽離子納米粒形成的復(fù)合物可以被有效地轉(zhuǎn)移到這兩種細(xì)胞內(nèi)得到表

6、達(dá)，其轉(zhuǎn)染效率比PAMAM、DNA復(fù)合物明顯升高。而且，轉(zhuǎn)染的最佳N、P比為0.9-1.5，復(fù)合物還沒有達(dá)到完全壓縮的狀態(tài)，可能有利于DNA從復(fù)合物中解離出來并進(jìn)入細(xì)胞核。 （4）采用乳化-分散-蒸發(fā)方法制備了含PAMAM的PLA納米粒，并與DNA復(fù)合，考察復(fù)合物的理化性質(zhì)/細(xì)胞毒性和轉(zhuǎn)染效率。瓊脂糖凝膠電泳/熒光置換/粒徑和電位測試的結(jié)果表明在N、P比2以上時(shí)，DNA與陽離子納米粒形成了穩(wěn)定且?guī)д姷膹?fù)合物。核酸酶酶切實(shí)驗(yàn)的結(jié)

7、果表明復(fù)合物能保護(hù)DNA抵御核酸酶的降解。MTT實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說明復(fù)合物的細(xì)胞毒性較小。在無血清介質(zhì)中，陽離子納米粒可以將DNA有效地轉(zhuǎn)移到兩種細(xì)胞內(nèi)得到表達(dá)，轉(zhuǎn)染效率與單純的PAMAM相比有明顯的提高，且轉(zhuǎn)染的最佳N、P比為2-5。 （5）薄膜超聲法制備DOTAP、DOPE陽離子脂質(zhì)體，并與PAMAM和DNA形成三元復(fù)合物，考察其理化性質(zhì)/細(xì)胞毒性和轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果表明在PAMAM與DNA比例r=0.5以上時(shí)（實(shí)驗(yàn)中陽離子脂質(zhì)體、D

8、NA的比例r’固定為3.0），形成了穩(wěn)定的復(fù)合物，能保護(hù)DNA免受核酸酶的降解，但是對細(xì)胞生長有一定程度的抑制。在有血清介質(zhì)中，與單純的陽離子脂質(zhì)體或PAMAM相比，該三元復(fù)合物在一定的r值范圍內(nèi)（從1.2到2）對HepG2細(xì)胞具有較高的轉(zhuǎn)染效率。 綜上所述，PAMAM與DNA通過靜電相互作用自組裝形成復(fù)合物，在一定程度內(nèi)可發(fā)生解離；但是當(dāng)N、P比大于2.0時(shí)，兩者的結(jié)合呈現(xiàn)出不可逆的趨勢。此外，PLGA/PLA納米粒和陽離子脂