聚酰胺-胺樹狀大分子抗菌作用研究及其機(jī)理探討.pdf

1、目的：
　　由于抗生素濫用導(dǎo)致的各種細(xì)菌耐藥在全世界范圍的蔓延愈演愈烈，許多原本可以治愈的感染性疾病，正在成為難以治愈的疾病。耐藥細(xì)菌的感染導(dǎo)致患者死亡率增加，感染并發(fā)癥增多，耐藥致病菌感染所致疾病已成為全人類共同的災(zāi)難。當(dāng)前細(xì)菌耐藥已呈現(xiàn)出向多藥耐藥發(fā)展的趨勢，一些細(xì)菌已經(jīng)演變?yōu)殡y以控制的“超級細(xì)菌”。更為嚴(yán)峻的是能夠抵抗所有抗生素的全耐藥細(xì)菌（panresistantbacteria）已經(jīng)出現(xiàn)，一旦人類感染這類細(xì)菌，可能會面臨

2、無藥可治的境地。面對多重耐藥細(xì)菌日趨增多和迅速蔓延，以及感染后致死率繼續(xù)攀高的嚴(yán)峻形勢，如何有效控制多重耐藥細(xì)菌感染造成的危害已經(jīng)成為各國政府高度關(guān)注的焦點(diǎn)，尋找和研制有效控制多重耐藥細(xì)菌感染的新策略和新藥物，已成為當(dāng)今世界各國科學(xué)家當(dāng)務(wù)之急的研究目標(biāo)。
　　抗生素是治療細(xì)菌感染最經(jīng)典的藥物，然而幾乎所有抗生素在治療細(xì)菌感染時都會不可避免地誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥。近半個世紀(jì)以來，抗生素研發(fā)策略仍局限于傳統(tǒng)抗生素結(jié)構(gòu)改造和修飾，新抗生素用于臨

3、床后細(xì)菌又會很快產(chǎn)生耐藥，故新型抗生素的研制并不能從根本上解決細(xì)菌耐藥問題。而且抗生素耐藥菌株的出現(xiàn)速度已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了新抗生素研發(fā)的速度，臨床有效的抗菌藥物日趨減少。為了有效對抗日益嚴(yán)重的耐藥細(xì)菌，必須突破傳統(tǒng)思路，尋找具有新型結(jié)構(gòu)且不誘導(dǎo)耐藥的抗菌藥物。
　　聚酰胺-胺（polyamidoamine,PAMAM）是一種人工合成的納米級大分子化合物，由于具有單分散性、內(nèi)部空腔及表面豐富的可修飾基團(tuán)等獨(dú)特結(jié)構(gòu)優(yōu)勢，PAMAM在生物醫(yī)

4、藥領(lǐng)域，如基因藥物載體、助溶劑、高效催化劑及納米材料等方面，有非常廣泛的應(yīng)用和研究。新近研究發(fā)現(xiàn)，高代數(shù)氨基末端的PAMAM（PAMAM-NH2）體外具有顯著的抗菌活性，如G3.0和G5.0能顯著抑制銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）和金黃色葡萄球菌（S.aureus）的生長。與現(xiàn)有的各類抗生素和抗菌藥物的分子結(jié)構(gòu)相比較，PAMAM-NH2是一類結(jié)構(gòu)新穎的抗菌分子，其抗菌作用可能與其末端氨基數(shù)目有關(guān)。PAMAM-NH2合成方法成熟

5、，目前市售有G1.0-G10.0等數(shù)十種，隨著代數(shù)的增加，PAMAM納米尺寸、末端氨基數(shù)目、形狀和結(jié)構(gòu)特征也會隨之變化。那么，究竟PAMAM-NH2是否可以成為理想的抗菌候選分子，目前尚無明確的結(jié)論。回答上述問題至少應(yīng)當(dāng)明確：PAMAM-NH2的抗菌活性與其代數(shù)之間存在何種規(guī)律；PAMAM-NH2的抗菌譜主要包括哪些？PAMAM-NH2的體內(nèi)毒性如何；PAMAM-NH2對細(xì)菌和哺乳類細(xì)胞的選擇性如何；PAMAM-NH2在感染動物體內(nèi)是否

6、具有抗菌作用；PAMAM-NH2是否誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥；○7PAMAM-NH2可能的作用機(jī)理是什么；○8如何提高PAMAM-NH2靶向抗菌作用從而降低其毒性。本課題針對上述未知領(lǐng)域展開了系統(tǒng)研究，旨在全面評價PAMAM-NH2作為新型抗菌劑的可能性，并探討其可能的抗菌作用機(jī)理。
　　方法：
　　1.G1.0-G4.0PAMAM-NH2體外抗菌活性的研究：
　　分別測定G1.0-G4.0PAMAM-NH2對17株檢測菌株（包括

7、6株耐藥菌株）的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）；測定G1.0-G4.0PAMAM-NH2對大腸埃希菌E.coliMG1655和對萬古霉素中度耐藥的S.aureusMu50的生長抑制情況；通過平板克隆形成實(shí)驗(yàn)，計數(shù)產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBLs）的大腸埃希菌（ESBLs-EC）和耐甲氧西林的S.aureus（MRSA）的菌落數(shù)（CFU），觀察G1.0-G4.0PAMAM-NH2對其生長的抑制程度。
　　2.G1.0-

8、G4.0PAMAM-NH2對人胃黏膜上皮細(xì)胞（GES-1）的毒性研究
　　通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測G1.0-G4.0PAMAM-NH2對GES-1的細(xì)胞毒性。
　　3.G2.0PAMAM-NH2誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥性的研究
　　分別測定G2.0PAMAM-NH2對受試菌株ESBLs-EC和S.aureusATCC29213的MIC值，每天測定1次，連續(xù)15天，計算待測藥物對第15代培養(yǎng)細(xì)菌的MIC值與第1代培養(yǎng)細(xì)菌的MIC值的相對值

9、。
　　4.G2.0-G4.0PAMAM-NH2對ESBLs-EC和MRSA生物被膜形成的影響
　　將G2.0-G4.0PAMAM-NH2分別與ESBLs-EC和MRSA共培養(yǎng)7天，通過銀染法檢測PAMAM-NH2對生物被膜形成的影響；待生物被膜形成后，分別加入不同濃度的G2.0PAMAM-NH2培養(yǎng)24后，計算生物被膜內(nèi)活菌數(shù)目以檢測G2.0PAMAM-NH2對被膜菌的抑制能力。
　　5.G2.0PAMAM-NH2對

10、BALB/c小鼠急性毒性研究
　　通過改良寇氏法急性毒性實(shí)驗(yàn)方法，評估腹腔注射G2.0對BALB/c小鼠的半數(shù)致死劑量，并通過小鼠臟器組織HE染色，觀察G2.0對BALB/c小鼠各個臟器的毒性損傷。
　　6.G2.0PAMAM-NH2對膿毒血癥感染動物的治療作用
　　分別構(gòu)建ESBLs-EC感染BALB/c小鼠膿毒血癥模型和ESBLs-EC與MRSA混合感染的BALB/c小鼠膿毒血癥模型，觀察腹腔注射10mg/kg、2

11、0mg/kg及10+10mg/kg（感染前12h和感染后0.5h分別給予一次）G2.0對小鼠生存時間及生存率的影響；通過測定BALB/c小鼠血液CFU，觀察G2.0對小鼠血液菌落數(shù)的影響；通過小鼠肺臟和肝臟組織HE染色，觀察G2.0PAMAM-NH2對膿毒血癥小鼠臟器的保護(hù)作用。
　　7.G2.0PAMAM-NH2抗菌作用機(jī)理探討
　　將ESBLs-EC分別與G2.0PAMAM-NH2作用30、120、300min，通過掃描

12、電鏡（SEM）和透射電鏡（TEM）觀察細(xì)菌形態(tài)學(xué)和微觀結(jié)構(gòu)變化。
　　8.meta-LED209-PAMAMG3.0的合成、表征及活性檢測
　　經(jīng)系統(tǒng)的文獻(xiàn)查閱分析后發(fā)現(xiàn)，LED209是一種新發(fā)現(xiàn)、強(qiáng)效且無毒的革蘭氏陰性菌膜受體QseC抑制劑，能有效抑制QseC與信號分子結(jié)合，進(jìn)而抑制下游致病基因的表達(dá)。為進(jìn)一步提高PAMAM抗菌作用的靶向性，故本實(shí)驗(yàn)選擇LED209化學(xué)修飾PAMAMG3.0，旨在得到具有細(xì)菌靶向且安全低毒

13、的新型抗菌分子。
　　（1）LED209羧基衍生物的合成、表征及活性檢測
　　設(shè)計并合成苯環(huán)對位及間位LED209羧基衍生物para-LED209-COOH和meta-LED209-COOH，經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振氫譜（1HNMR）結(jié)構(gòu)表征，經(jīng)高效液相色譜（HPLC）測定純度；通過檢測不同濃度的para/meta-LED209-COOH對腸出血性大腸桿菌（EHEC）生長曲線的影響，評估其體外抑菌活性；PCR法檢測不同濃度的para

14、/meta-LED209-COOH對EHEC菌膜QseC受體下游基因表達(dá)的抑制情況，評價para/meta-LED209-COOH拮抗QseC受體的活性差異。
　?。?）meta-LED209-PAMAMG3.0的合成、表征及活性檢測
　　合成meta-LED209-PAMAMG3.0，通過1HNMR和核磁共振碳譜（13CNMR）進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，經(jīng)元素分析計算終產(chǎn)物結(jié)構(gòu)組成；通過檢測G3.0meta-LED209-PAMAM對

15、12株革蘭氏陰性菌（包括3株耐藥菌株）的MIC值，與G3.0PAMAM比較，判斷其抗菌活性的變化；PCR法檢測不同濃度的G3.0meta-LED209-PAMAM對EHEC致病基因表達(dá)的影響，評估其對QseC受體的抑制效率；MTT法檢測不同濃度的G3.0meta-LED209-PAMAM對GES-1、SW480和MC3T3細(xì)胞的毒性，判斷其細(xì)胞毒性的變化；合成G3.0PAMAM-FITC和G3.0FITC-PAMAM-LED209，通過

16、紫外分光光度計計算FITC的含量；將標(biāo)記FITC的G3.0和G3.0-LED209，分別與EHEC和SW480共孵育，與不同時間點(diǎn)熒光顯微鏡觀察，判斷LED209修飾的G3.0與EHEC和SW480親和力的差別。
　　結(jié)果：
　　1.G1.0-G4.0PAMAM-NH2體外抗菌活性的研究
　　MIC結(jié)果表明G1.0-G4.0PAMAM-NH2體外抗菌譜廣，對革蘭氏陽性菌、陰性菌的敏感和耐藥菌株均有不同程度的抑制和殺滅作

17、用，其中G2.0作用最強(qiáng)（MIC值為0.78-12.5μg/mL），G3.0和G4.0次之（MIC值為1.56-25μg/mL），G1.0作用最弱（MIC≥50μg/mL）；MBC結(jié)果提示，G2.0PAMAM-NH2對所測菌株的MBC是MIC值的2-4倍；生長曲線提示，PAMAM-NH2抗菌作用呈濃度依賴效應(yīng)，且同等濃度下，G2.0抗菌作用最強(qiáng)；殺菌曲線提示，12μMG2.0-G4.0PAMAM-NH2對ESBLs-EC和MRSA具有顯

18、著的殺菌活性，G2.0與ESBLs-EC作用2h后活菌計數(shù)即接近零，MRSA作用6h后活菌計數(shù)接近零，而60μMG1.0未顯示殺菌作用。
　　2.G1.0-G4.0PAMAM-NH2對GES-1的細(xì)胞毒性研究
　　MTT結(jié)果提示，PAMAM-NH2的細(xì)胞毒性與濃度和代數(shù)呈正相關(guān)，即濃度和代數(shù)越高，毒性越大。在所檢測的最高濃度1024μg/mL時，G1.0處理組顯示無細(xì)胞毒性（P>0.05），G2.0和G3.0濃度≤102.4

19、μg/mL時，細(xì)胞生存率無顯著性變化（P>0.05），而G4.0濃度≥0.512μg/mL時，即呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性（P<0.05）。
　　3.G2.0PAMAM-NH2誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥研究
　　耐藥性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與ATCC29213共孵育連續(xù)培養(yǎng)15代后，G2.0、紅霉素、苯唑西林和頭孢他啶的MIC與第1代培養(yǎng)所測MIC的相對比值，分別是1、64、8和8；與ESBLs-EC共孵育連續(xù)培養(yǎng)15代后，G2.0、左氧氟沙星、氨芐西林

20、和頭孢他啶所測MIC與第1代培養(yǎng)所測MIC的相對比值，分別是1、64、32和8，提示ATCC29213和ESBLs-EC不易對G2.0PAMAM-NH2產(chǎn)生耐藥，而容易對抗生素產(chǎn)生耐藥性。
　　4.G2.0-G4.0對ESBLs-EC和MRSA生物被膜的抑制
　　銀染法結(jié)果證實(shí)20μg/mLG2.0-G4.0PAMAM均可減少黑色棉絮樣膜狀物，可抑制ESBLs-EC和MRSA生物被膜的形成；而ESBLs-EC和MRSA被膜菌

21、對左氧氟沙星和G2.0PAMAM均具有抵抗性。
　　4.G2.0PAMAM-NH2對BALB/c小鼠急性毒性研究
　　BALB/c小鼠腹腔注射G2.0急性毒性結(jié)果表明，LD50的平均可信區(qū)間為84.04±21.72mg/kg；HE染色結(jié)果顯示，腹腔注射180mg/kgG2.0后，小鼠各臟器（心、肝、脾、肺、腎）均有微血栓形成，可見明顯的血管內(nèi)凝血和出血，其中肝臟、腎臟最為嚴(yán)重，肺臟損傷較輕，血栓形成較少見。
　　5.G

22、2.0PAMAM-NH2對膿毒血癥感染動物的治療作用
　　ESBLs-EC所致的BALB/c小鼠膿毒血癥模型實(shí)驗(yàn)中，10+10mg/kg和20mg/kg組G2.0PAMAM-NH2可顯著延長小鼠的生存時間，與模型組相比，生存率分別從0％提高至100％（P<0.01）和41.67％（P<0.05），并顯著降低小鼠血液CFU計數(shù)（P<0.05和P<0.01），明顯減輕小鼠肺臟和肝臟損傷；對ESBLs-EC和MRSA混合感染所致的BAL