一個(gè)新的肺纖維化相關(guān)的α-SMA基因轉(zhuǎn)錄激活子—HMG1的克隆與初步功能研究.pdf

1、目的：哮喘氣道重塑、肺間質(zhì)纖維化以及其它許多纖維化性疾病的一個(gè)共同病理過程就是表達(dá)α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的肌纖維母細(xì)胞的異常活化與增多。研究α-SMA表達(dá)調(diào)控，這對(duì)于揭示纖維化相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制將具有十分重要的意義。然而迄今為止人們對(duì)α平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制仍了解甚少，還有許多重要的轉(zhuǎn)錄因子和反應(yīng)元件尚未被發(fā)現(xiàn)和揭示。我們?cè)谇捌诘难芯抗ぷ髦欣煤怂?蛋白親和層析方法篩選到了一個(gè)屬于高遷移率蛋白家族-1(HMG-B1)成

2、員的，可能參與α-SMA啟動(dòng)子活化的蛋白-HMG-1。本研究主要探討了HMG-1作為轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控α-SMA基因轉(zhuǎn)錄的可能性，以及對(duì)α平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)的影響。 方法：1、構(gòu)建α-SMA啟動(dòng)子紅色熒光報(bào)告質(zhì)粒。 2、提取小鼠肺組織的總RNA用RT-PCR方法克隆HMG-1序列并將其亞克至真核表達(dá)載體pcDNA3.O和綠色熒光報(bào)告載體pEGFP-N2上。 3、將α-SMA啟動(dòng)子紅色熒光報(bào)告質(zhì)粒和HMG-1真核表達(dá)

3、載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到3T3細(xì)胞和16HBE細(xì)胞中觀察過表達(dá)HMG1對(duì)α-SMA啟動(dòng)子活化的影響。 4、用RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染HMG1真核表達(dá)載體細(xì)胞中α-SMA基因轉(zhuǎn)錄水平。 5、建立博萊霉素致肺纖維化的小鼠動(dòng)物模型，應(yīng)用HMG1RNAi干擾HMG1的表達(dá)，Westernblot檢測α-SMA蛋白表達(dá)水平。 6、電泳遷移率分析(EMSA)檢測HMG1和α-SMA啟動(dòng)子CArGA序列特異性的結(jié)合。 結(jié)果：1、酶

4、切鑒定及測序結(jié)果證實(shí)成功構(gòu)建了α-SMA啟動(dòng)子紅色熒光報(bào)告質(zhì)粒pDsRed-SMA，HMG-1綠色熒光報(bào)告質(zhì)粒pEGFP-N2-HMG1及pcDNA3.0-HMG質(zhì)粒。 2、轉(zhuǎn)染pEGFPn2-HMG的16HBE細(xì)胞，綠色熒光蛋白的表達(dá)主要定位于細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)染空載體pEGFPn2的細(xì)胞明顯不同。RT-PCR結(jié)果證實(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞能夠表達(dá)外源HMG基因。 2、共轉(zhuǎn)染pDsRed-SMA啟動(dòng)子紅色熒光報(bào)告質(zhì)粒和pcDNA3.O-H

5、MG真核表達(dá)質(zhì)粒顯示：細(xì)胞過表達(dá)HMG-1能夠活化α-SMA啟動(dòng)子。轉(zhuǎn)染pcDNA3.O-HMG質(zhì)粒的16HBE細(xì)胞顯著增加α-SMA基因轉(zhuǎn)錄。 3、Westernblot結(jié)果顯示博萊霉素致纖維化小鼠肺組織HMG1表達(dá)較同期正常對(duì)照小鼠顯著增加，相應(yīng)α-SMA水平亦較正常小鼠增加，應(yīng)用HMG1RNAi治療的纖維化小鼠肺組織HMG1表達(dá)被下調(diào)，與此亦同樣觀察到α-SMA水平下降。 結(jié)論： 1、初步證明我們?cè)诓┤R霉素