一個(gè)棉花蔗糖合酶基因的克隆、鑒定與功能研究.pdf

1、棉花作為世界性的重要經(jīng)濟(jì)作物，產(chǎn)生的天然纖維是重要的紡織工業(yè)原料。單細(xì)胞結(jié)構(gòu)的棉纖維為研究相關(guān)基因在發(fā)育中的功能提供了一個(gè)良好的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。大量基因在棉花不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)，控制著胚珠和纖維的發(fā)育。而棉花纖維發(fā)育相關(guān)基因的克隆和遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立為棉花重要基因的功能驗(yàn)證和目標(biāo)性狀的遺傳改良奠定了基礎(chǔ)。蔗糖合酶(SuSy，EC2.4.1.13)作為促使蔗糖進(jìn)入各種代謝途徑的關(guān)鍵酶之一，普遍存在于原核生物和真核生物體內(nèi)。其產(chǎn)物二磷酸尿核苷葡萄糖

2、(UDP-Glc)被認(rèn)為是棉纖維細(xì)胞次生壁中纖維素合成最直接的底物。
　　本研究從7235文庫中獲得了一段棉花蔗糖合酶基因片段，通過TAIL-PCR技術(shù)克隆得到了該基因基因組全長，一共為5582bp，包含15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子。并獲得了2790bp的cDNA全長，其中ORF為2430bp，共編碼809個(gè)氨基酸，將其命名為GhSUSA1。該基因?qū)儆谔腔D(zhuǎn)移酶-1家族，包含典型的糖基轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域，并具有多處磷酸化位點(diǎn)。從兩個(gè)二倍體棉

3、種中分別得到了GhSUSA1基因序列，并證明陸地棉基因組的A、D亞基因組各存在一個(gè)拷貝。該基因在棉花各個(gè)不同組織中組成性表達(dá)，其中根和雄蕊中表達(dá)量高;在纖維發(fā)育不同時(shí)期表達(dá)量有差異，起始期和次生壁加厚期優(yōu)勢表達(dá)，伸長期胚珠中表達(dá)量高于纖維。分析該基因在不同遺傳材料中的差異表達(dá)發(fā)現(xiàn)，該基因在兩個(gè)無絨無絮突變體中0DPA表達(dá)被抑制，而在高強(qiáng)纖維品系7235中伸長期表達(dá)水平高于TM-1。GhSUSA1與棉花中其他兩個(gè)蔗糖合酶基因比較，雖然在氨

4、基酸序列上有一定相似性，但是這種相似性遠(yuǎn)小于不同物種同一類型基因間的相似性。無論從結(jié)構(gòu)還是進(jìn)化距離上來說，三個(gè)基因均有很大差異。
　　我們利用反向遺傳學(xué)技術(shù)，研究棉花蔗糖合酶(SocroseSynthase，SuSy)基因GhSUSA1在棉纖維發(fā)育中的功能。通過原核表達(dá)技術(shù)，從大腸桿菌中純化到預(yù)期大小的由GhSUSA1表達(dá)的蛋白，酶活性測定發(fā)現(xiàn)其具有典型的蔗糖合酶活性。為進(jìn)一步研究該基因的功能，用pBI121質(zhì)粒載體分別構(gòu)建了E6

5、棉纖維?；磉_(dá)啟動子驅(qū)動的反義表達(dá)載體(E6AS-SA)和組成性CaMV35S啟動子驅(qū)動的反義表達(dá)載體(35AS-SA);并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將兩個(gè)載體導(dǎo)入棉花W0品系，通過棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑獲得轉(zhuǎn)基因植株;對每個(gè)再生單株都進(jìn)行NPTⅡ和啟動子-基因特異的PCR檢測，經(jīng)過連續(xù)兩個(gè)世代的選擇，獲得了12個(gè)轉(zhuǎn)基因株系。Southern雜交分析表明，這12個(gè)轉(zhuǎn)基因株系含有一個(gè)至四個(gè)拷貝不等。這些GhSUSA1的反義轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)

6、出纖維顯著變短的表型，部分株系纖維的強(qiáng)度和細(xì)度也有所變化。選取其中7個(gè)只有GhSUSA1被顯著抑制的轉(zhuǎn)基因純合株系進(jìn)一步分析其在棉花發(fā)育中的功能。定量RT-PCR和酶活性檢測發(fā)現(xiàn)，GhSUSA1在四個(gè)E6AS-SA轉(zhuǎn)基因株系5DPA纖維中的表達(dá)都受到了不同程度抑制、酶活水平降低;雖然沒有引起最終纖維素含量發(fā)生變化，但是通過測定棉纖維中的糖含量發(fā)現(xiàn)，果糖和葡萄糖含量明顯下降，蔗糖含量除了一個(gè)株系外也都有所下降，這與酶活水平是一致的，在35

7、AS-SA的轉(zhuǎn)基因株系中，除了發(fā)現(xiàn)纖維變短外，還有更明顯的種子變小現(xiàn)象，鈴重和百粒重均比對照有所下降，純系種子的苗期生物量也出現(xiàn)下降;我們測定了三個(gè)35AS-SA反義株系10～20DPA種子中GhSUSA1的表達(dá)量變化，發(fā)現(xiàn)10DPA下降最明顯，相應(yīng)酶活水平也比對照有所下降，三種糖含量下降明顯;成熟種子中淀粉含量的測定結(jié)果表明:轉(zhuǎn)基因株系中淀粉含量比對照顯著減少，尤其是抑制最為明顯的45-49株系。這些結(jié)果表明，GhSUSA1基因在棉纖

8、維中的抑制表達(dá)導(dǎo)致酶活下降，從而引起可溶性糖含量減少，縮小了伸長期纖維和種皮細(xì)胞之間的膨壓差，引起纖維長度變短;而在棉花中的組成性抑制則影響了整個(gè)庫強(qiáng)與生物量，使得種子淀粉合成量下降，減少了鈴重和百粒重。
　　為了進(jìn)一步驗(yàn)證GhSUSA1基因的功能，用pBI121質(zhì)粒載體構(gòu)建了GhSUSA1的CaMV35S組成性表達(dá)啟動子驅(qū)動的過量表達(dá)載體(35S-SA)，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化胚性愈傷的方法將這個(gè)表達(dá)載體轉(zhuǎn)入棉花W0品系。T0和T1代

9、轉(zhuǎn)基因植株有發(fā)生GhSUSA1正義共抑制的現(xiàn)象，但是也有植株出現(xiàn)了表達(dá)量升高的現(xiàn)象，并且過量表達(dá)該基的植株相應(yīng)的糖含量和T2代苗期生物量均有所增加，還有部分株系出現(xiàn)纖維變長的表型，但是T1代有分離，具體結(jié)果需要通過純系的獲得進(jìn)一步加以驗(yàn)證。
　　此外，在進(jìn)行棉花的遺傳轉(zhuǎn)化中，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)性狀可遺傳的節(jié)間伸長的突變體株系，分析了該株系的表型變異并對其插入?yún)^(qū)段進(jìn)行了初步鑒定。另外轉(zhuǎn)基因過程還出現(xiàn)了芽黃突變體和卷葉突變體，這些突變體株系的