加味左金丸治療胃癌前病變大鼠的作用機(jī)理研究.pdf

1、目的:模擬人的患病因素制作胃癌前病變大鼠模型,觀察加味左金丸對胃癌前病變的治療作用并從分子水平探討其作用機(jī)理.方法:1.造模方法采用改進(jìn)的綜合造模方法.具體如下:每日自由飲用100ug/mlMNNG(甲硝基亞硝基胍液)(飲水瓶用油漆涂黑避光),進(jìn)食含0.03%雷尼替丁的純鼠顆粒飼料,上午用56℃15%鹽水按10ml/kg灌胃;進(jìn)食兩天、禁食一天,進(jìn)食當(dāng)天下午用20mmol(0.85%)脫氧膽酸鈉溶液按10ml/kg灌胃,禁食當(dāng)天下午用4

2、0%酒精按10ml/kg灌胃;每周用鉗子夾住大鼠的尾部一次,使之保持激怒、爭斗狀態(tài),持續(xù)30分鐘.上述方法連續(xù)造模24周.24周末時(shí)隨機(jī)抽取正常組和造模大鼠各一只,殺檢,觀察組織病理學(xué)變化(以HE染色光學(xué)顯微鏡下觀察的結(jié)果為主),確認(rèn)模型是否成功.2.動(dòng)物分組SPF級(jí)6周齡Wistar雄性大鼠60只,隨機(jī)抽取10只作為正常對照組(簡稱正常組)(n=10),余下的50只造模,取其中造模成功的43只(另7只中,1只為正常按時(shí)殺檢,6只為死亡

3、)隨機(jī)分為模型對照組(簡稱模型組)(n=11)、維甲酸組(n=8)、加味左金丸高劑量組(簡稱高劑量組)(n=8)、加味左金丸中劑量組(簡稱中劑量組)(n=8)、加味左金丸低劑量組(簡稱低劑量組)(n=8).3.給藥劑量造模24周后即造模成功后,正常組不作任何處理,模型組大鼠每日按10ml/kg灌胃蒸餾水;加味左金丸高、中、低劑量組每日分別給于200%、100%、50%不同濃度的加味左金丸藥液10ml/kg灌胃;維甲酸組按10ml/kg灌

4、胃.每日一次,連續(xù)16周.4.觀察指標(biāo)①一般情況:觀察各組大鼠進(jìn)食、飲水、精神狀態(tài)、形體、活動(dòng)情況、被毛光澤度、大便情況及存活情況.②體重:從實(shí)驗(yàn)開始,每月稱取體重一次,并計(jì)算給藥前后各組大鼠體重的平均值,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較.③胃粘膜肉眼觀察:觀察給藥前后各組大鼠胃粘膜色澤、皺壁排列、炎癥情況及胃壁的伸展性等.④胃粘膜HE染色光學(xué)顯微鏡下觀察:觀察各組大鼠給藥前后胃粘膜的病理組織學(xué)改變,計(jì)數(shù)各組淺表性胃炎(CSG)、萎縮性胃炎(CAG)、腸

5、上皮化生(IM)、不典型增生(ATP)和增生結(jié)節(jié)發(fā)生例數(shù).胃粘膜組織學(xué)改變的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照實(shí)驗(yàn)性胃腺癌的分類和診斷標(biāo)準(zhǔn).實(shí)驗(yàn)過程中死亡的大鼠不進(jìn)行組織學(xué)觀察和統(tǒng)計(jì)分析.⑤免疫組織化學(xué)染色檢測增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)并計(jì)算增殖指數(shù)(PI).⑥免疫組織化學(xué)染色檢測表皮生長因子受體(EGFR)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、肝細(xì)胞生長因子受體(C-met)、凋亡抑制因子-2(Bcl-2)等癌基因蛋白表達(dá)情況.⑦免疫組織化學(xué)染色檢測環(huán)氧合酶-2

6、(COX-2)、端粒酶催化活性亞單位(h-TERT).⑧原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測凋亡細(xì)胞并計(jì)算凋亡指數(shù)(AI).結(jié)果:1.一般情況造模大鼠在造模開始后8周即開始出現(xiàn)活動(dòng)量、食量、體重、被毛、大便等方面的變化,至24周時(shí)(即模型成功時(shí))上述改變更加明顯;模型組大鼠形體消瘦,活動(dòng)減少,被毛無光澤,食量少,大便稀溏;加味左金丸高、中、低劑量組上述表現(xiàn)均不同程度好轉(zhuǎn),食量和活動(dòng)增加,體重上升,大便成形;維甲酸組大鼠食量有所增加,但被毛欠

7、光澤,體重有所上升,大便成形.加味左金丸高、中、低劑量組①均能增加模型大鼠的食量、體重和改善被毛、大便等一般情況,與模型組比較有極顯著性差異(P<0.01),與維甲酸組比較有顯著性差異(P<0.05);②明顯降低模型大鼠的死亡率,模型組的死亡率54.55%,加味左金丸高、中、低劑量組和維甲酸組死亡率為0,與前者比較有極顯著性差異(P<0.01).2.病理學(xué)變化(1)肉眼觀察:造模24周時(shí),模型大鼠胃腔變形,胃粘膜呈灰白色,胃壁增厚,伸展

8、性差,粘膜皺壁紊亂.實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),模型組大鼠胃粘膜黃染,皺壁平坦,存活5例中有2例出現(xiàn)增生結(jié)節(jié),1例位于十二指腸,如黃豆大小,呈菜花狀,質(zhì)硬(組織學(xué)檢查為早期腺癌),1例位于胃竇部,如綠豆大小,圓形,質(zhì)中(組織學(xué)檢查為增生性息肉);維甲酸組大鼠粘膜較暗淡,較正常粘膜變薄,未見增生結(jié)節(jié);加味左金丸高、中、低劑量組大鼠粘膜呈粉紅色,皺壁排列規(guī)則,未見增生結(jié)節(jié).(2)HE染色光學(xué)顯微鏡下觀察:①加味左金丸高、中、低劑量組能改善模型大鼠CSG、C

9、AG胃粘膜炎癥,與模型組比較有顯著性差異(P<0.05),與維甲酸組比較無顯著性差異(P>0.05),僅中劑量組在改善模型大鼠CSG方面優(yōu)于維甲酸組(P<0.05);②加味左金丸高、中、低劑量組降低模型大鼠IM、ATP的發(fā)生率,與模型組比較,高、低劑量組有顯著性差異(P<0.05),中劑量組有極顯著性差異(P<0.01);與維甲酸組比較,加味左金丸高、中、低劑量組均無顯著性差異(P>0.05).3.PCNA及EGFR、VEGF、c-me

10、t癌基因蛋白的表達(dá)情況①PCNA染色陽性定位于細(xì)胞核.正常大鼠胃粘膜增生帶細(xì)胞可見PCNA陽性細(xì)胞,但其PI與模型組比較有極顯著性差異(P<0.01);加味左金丸高、中、低劑量組及維甲酸組PI與模型組比較有極顯著性差異(P<0.01);加味左金丸高、中、低劑量組與維甲酸比較有顯著性差異(P<0.05),與正常組比較元顯著性差異(P>0.05),加味左金丸低、中、高劑量組之間無顯著性差異(P>0.05).②EGFR染色陽性定位于胞漿及胞膜

11、上.正常大鼠胃粘膜可有EGFR蛋白表達(dá),主要分布在靠近腺體基底部的增殖細(xì)胞中.模型組大鼠EGFR蛋白呈100%表達(dá),染色陽性程度高.加味左金丸高、中、低劑量組EGFR蛋白陽性例(率)降低,中劑量組與模型組比較有極顯著性差異(P<0.01),高、低劑量組與模型組比較有顯著性差異(P<0.05),加味左金丸高、中、低劑量組染色陽性程度降低,與模型組比較有顯著性差異(P<0.05);維甲酸組與模型組比較,EGFR蛋白陽性例(率)無顯著性差異(

12、P>0.05),但染色陽性程度降低,與模型組比較有顯著性差異(P<0.05);加味左金丸高、中、低劑量組EGFR蛋白陽性例(率)及染色陽性程度與維甲酸組比較無顯著性差異(P>0.05).③VEGF染色陽性定位于細(xì)胞漿.正常大鼠胃粘膜沒有VEGF蛋白表達(dá).模型組5例全呈陽性表達(dá),陽性率100%,染色陽性程度高.加味左金丸高、中、低劑量組VEGF蛋白陽性例(率)降低,中、低劑量與模型組比較有顯著性差異(P<0.05),高劑量組與之比較無顯著

13、性差異(P>0.05),但加味左金丸高、中、低劑量組染色陽性程度降低,與模型組比較有顯著性差異(P<0.05);維甲酸組VEGF蛋白陽性例(率)和染色陽性程度均降低,與模型組比較,有顯著性差異(P<0.05);加味左金丸高、中、低劑量組VEGF蛋白陽性例(率)及染色陽性程度與維甲酸組比較無顯著性差異(P>0.05).④C-met染色陽性定位于細(xì)胞漿.正常大鼠胃粘膜可有C-met蛋白表達(dá),主要分布在腺頸部.模型組大鼠5例全呈陽性表達(dá),陽性

14、率100%,染色陽性程度高.加味左金丸高、中、低劑量組及維甲酸組C-met蛋白陽性例(率)與模型組比較,無顯著性差異(P>0.05),但染色陽性程度與模型組比較有顯著性差異(P<0.05);加味左金丸高、中、低劑量組C-met蛋白陽性例(率)及染色陽性程度與維甲酸組比較無顯著性差異(P>0.05).4.細(xì)胞凋亡檢測及其調(diào)控基因Bcl-2蛋白表達(dá)情況①細(xì)胞凋亡檢測:TUNEL陽性細(xì)胞在普通光鏡下的特征是:細(xì)胞收縮變小,呈圓形,與周圍細(xì)胞分

15、離,凋亡細(xì)胞胞核被染成藍(lán)黑色.與正常組相比,模型組大鼠TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目較少且散在分布,AI明顯降低;加味左金丸中劑量組和維甲酸組見較多的TUNEL陽性細(xì)胞,AI明顯上升,與模型組比較有極顯著性差異(P<0.01),但兩者之間比較,無顯著性差異(P>0.05);加味左金丸高、低劑量組TUNEL陽性細(xì)胞也有一定增多,AI有一定的上升,與模型組比較,無顯著性差異(P>0.05).②Bcl-2蛋白表達(dá)情況:bcl-2染色陽性定位于胞漿.正

16、常組大鼠Bcl-2蛋白無陽性表達(dá);模型組大鼠5例全呈陽性表達(dá),陽性率100%,;加味左金丸高、中劑量組和維甲酸組Bcl-2蛋白表達(dá)降低,與模型組比較,有極顯著性差異(P<0.01),加味左金丸低劑量組與模型組比較,有顯著性差異(P<0.05);加味金丸高、中、低劑量組和維甲酸組之間比較無顯著性差異(P>0.05).5.COX-2檢測情況COX-2染色陽性定位于胞漿內(nèi)或核膜上,呈棕黃色.正常大鼠胃粘膜可有COX-2表達(dá)(三)模型組大鼠CO

17、X-2蛋白積分明顯高于正常組(P<0.01).加味左金丸中劑量組COX-2蛋白積分與模型組相比較有極顯著性差異(P<0.01),加味左金丸低劑量組COX-蛋白2積分與模型組相比較有顯著性差異(P<0.05),加味左金丸高劑量組和維甲酸組與模型組相比較無顯著性差異(P>0.05);加味左金丸中劑量組COX-2蛋白積分與維甲酸組相比,有極顯著性差異(P<0.01);加味左金丸中劑量組COX-2蛋白積分與正常組接近(P>0.05).6.h-T

18、ERT檢測情況h-TERT染色陽性為棕黃色顆粒物質(zhì),定位于細(xì)胞漿.正常大鼠胃粘膜沒有h-TERT蛋白表達(dá).模型組5例全呈陽性表達(dá),陽性率100%,染色陽性程度高.加味左金丸中劑量組h-TERT蛋白陽性例(率)降低,與模型組比較有顯著性差異(P<0.05),加味左金丸高、低劑量組及維甲酸組與模型組比較無顯著性差異(P>0.05),但加味左金丸高、中、低劑量組及維甲酸組染色陽性程度與模型組比較均有顯著性差異(P<0.05);加味左金丸高、中