消痰和胃方對(duì)胃癌前病變大鼠胃黏膜細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、胃癌前病變(PLGC)是一類(lèi)易發(fā)生癌變的胃黏膜病理學(xué)變化，在其基礎(chǔ)上發(fā)生的胃黏膜細(xì)胞異型增生是胃癌發(fā)生的重要組織學(xué)基礎(chǔ)。在國(guó)內(nèi)胃癌發(fā)病率及死亡率的趨勢(shì)逐年升高。目前根據(jù)病因而采取的一級(jí)預(yù)防目前難以實(shí)現(xiàn)，因此對(duì)胃癌前病變的防治則成為胃癌二級(jí)預(yù)防的重點(diǎn)。胃癌前病變的治療國(guó)際上尚無(wú)統(tǒng)一規(guī)范及推薦藥物；中藥在本病的治療上取得了一定的成績(jī)，越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者重視。魏品康教授總結(jié)四十余年臨床經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為“痰濁內(nèi)蘊(yùn)”與胃癌前病變的產(chǎn)生密切相關(guān)，在此理

2、論基礎(chǔ)上，自創(chuàng)消痰和胃方（原名消痰養(yǎng)胃方）用于治療胃癌前病變，臨床結(jié)果表明該方能改善臨床癥狀，逆轉(zhuǎn)病理狀態(tài)，但機(jī)制尚不明確。而現(xiàn)代研究證實(shí)胃癌前病變的發(fā)生主要是胃黏膜細(xì)胞凋亡紊亂所致，并且NF-κB通路與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。因此消痰和胃方是否通過(guò)調(diào)控NF-κB通路，影響PLGC胃黏膜細(xì)胞凋亡，最終逆轉(zhuǎn)PLGC是本次實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)探討的問(wèn)題。
　　目的：
　　以化學(xué)致癌物N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍（MNNG）誘導(dǎo)為主的多因素造

3、模法建立胃癌前病變大鼠模型，HE染色觀察消痰和胃方對(duì)胃癌前病變大鼠胃黏膜組織病理學(xué)的影響；TUNNEL法檢測(cè)消痰和胃方對(duì)胃癌前病變大鼠胃黏膜細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響；采用免疫組織化學(xué)等技術(shù)檢測(cè)消痰和胃方對(duì)胃癌前病變大鼠胃黏膜細(xì)胞Bax、BCl-2及Caspase-3蛋白表達(dá)的影響；western blot檢測(cè)消痰和胃方通過(guò)改變胃癌前病變大鼠胃黏膜組織NF-κB通路相關(guān)蛋白的影響，從而干預(yù)下游凋亡相關(guān)因子的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)胃癌前病變胃黏膜細(xì)胞凋

4、亡，最終逆轉(zhuǎn)胃癌前病變。
　　方法：
　　第一部分：70只雄性Wistar大鼠，6周齡，隨機(jī)分為空白組及模型組。正常對(duì)照組15只，模型組55只。采用MNNG為主的多因素造模法建立胃癌前病變大鼠模型。每3天1次給予300μg/mL的MNNG灌胃，同時(shí)3天1次給予無(wú)水乙醇1ml灌胃，2天給予飲食1天禁食，每周三上午9AM夾尾使大鼠保持爭(zhēng)奪激怒10min?？偣?2周。造模過(guò)程中死亡5只。32周后模型組隨機(jī)取8只大鼠、空白組隨機(jī)取1

5、只大鼠的胃大彎處胃黏膜組織固定，石蠟包埋切片，HE染色，病理確認(rèn)造模成功。
　　第二部分：將造模成功的雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組、維酶素組、消痰和胃組。消痰和胃方藥物組成：全方由制半夏15g、黃連9g、炒枳殼15g、桂枝9g、細(xì)辛6g、白芍15g、炙甘草6g等藥物。消痰和胃組、維酶素組、模型對(duì)照組及正常對(duì)照組分別以6g/mL的中藥水煎膏、維酶素混懸濁液、生理鹽水（后兩組）灌胃，持續(xù)6周。并每周相同時(shí)間記錄大鼠體重變化情

6、況。6周結(jié)束后，將胃大彎處胃黏膜組織固定,石蠟包埋切片,HE染色，觀察組織病理學(xué)改變情況。
　　第三部分：雄性Wistar大鼠分組給藥同第二部分。6周后，麻醉處死大鼠，將胃大彎處胃黏膜組織固定，石蠟包埋切片。免疫組化法檢測(cè)胃癌前病變大鼠胃黏膜細(xì)胞中Bax、BCl-2及Caspase-3蛋白的表達(dá)。
　　第四部分：雄性Wistar大鼠分組給藥同第二部分。6周后，麻醉處死大鼠，將胃大彎處胃黏膜組織固定，石蠟包埋切片。TUNNEL

7、法檢測(cè)胃癌前病變大鼠胃黏膜細(xì)胞凋亡指數(shù)（PI）。
　　第五部分：雄性Wistar大鼠分組給藥同第二部分。6周后，麻醉處死大鼠，迅速將胃大彎處胃黏膜組織-80℃凍存。Western blot法檢測(cè)胃黏膜組織中NF-κB P65,p-NF-κB P65蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1、造模32周，兩組大鼠體重相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05），其中模型組體重增長(zhǎng)趨勢(shì)緩慢。造模階段兩組體重增長(zhǎng)值比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<

8、0.05）。光鏡觀察可見(jiàn)模型組胃黏膜不完整，萎縮，細(xì)胞形態(tài)不一致，表面可見(jiàn)脫落的上皮細(xì)胞，有的甚至有變性、壞死，腺體排列紊亂，部分細(xì)胞腺體有囊狀擴(kuò)張樣的改變。細(xì)胞核染色加深，有的可見(jiàn)核分裂像，表明細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的異型變化，部分還伴有腸上皮化生。
　　2、6周療程結(jié)束后，一般情況消痰和胃組與維酶素組均好于模型對(duì)照組，其中消痰和胃組較為明顯。消痰和胃組與正常對(duì)照組治療過(guò)程中無(wú)死亡；模型對(duì)照組死亡3只（21.43％），維酶素組死亡1只

9、（7.14%）；從第4周開(kāi)始，消痰和胃組與維酶素組及模型對(duì)照組體重值比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；維酶素組與模型對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組異型增生數(shù)相比，消痰和胃組與模型組及維酶素組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05），維酶素組與模型對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　3、免疫組化檢測(cè)Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)：消痰和胃組、維酶素組、模型對(duì)照組之間兩兩比較差異具有

10、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。
　　4、TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡指數(shù)：模型對(duì)照組與正常對(duì)照組相比AI值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);消痰和胃組和維酶素組、模型對(duì)照組相比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　5、Western blot檢測(cè)NF-κB P65,p- NF-κB P65蛋白表達(dá)：正常對(duì)照組與模型對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）,消痰和胃組與維酶素組、模型對(duì)照組之間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p

11、<0.05）；而維酶素組與模型對(duì)照組相比差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、胃癌前病變存在胃黏膜細(xì)胞的增殖與凋亡比例失調(diào)。
　　2、將導(dǎo)師胃癌痰證理論進(jìn)一步完善，從胃癌前病變的角度認(rèn)識(shí)胃癌防治的重要性，并且根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)從痰論治胃癌前病變合理有效。
　　3、消痰和胃方能改善胃癌前病變大鼠相關(guān)癥狀，促進(jìn)鼠毛再生，增加體重，逆轉(zhuǎn)胃癌前病變胃黏膜細(xì)胞異性增生。
　　4、消痰和胃方可增加胃癌

12、前病變大鼠胃黏膜細(xì)胞凋亡指數(shù)，促進(jìn)胃癌前病變胃黏膜細(xì)胞凋亡。
　　5、消痰和胃方可降低胃癌前病變胃黏膜組織中Bcl-2蛋白的表達(dá)，提高Bax、Caspase-3蛋白的表達(dá)，促進(jìn)胃癌前病變胃黏膜細(xì)胞的凋亡。
　　6、消痰和胃方能降低胃癌前病變胃黏膜組織中NF-κB通路相關(guān)蛋白NF-κB P65,p- NF-κB P65的表達(dá)，阻斷NF-κB通路的異常激活。說(shuō)明消痰和胃方逆轉(zhuǎn)胃癌前病變，促進(jìn)胃癌前病變胃黏膜細(xì)胞凋亡，可能是通過(guò)對(duì)