中藥通過線粒體途徑治療胃癌前病變大鼠的實驗研究.pdf

1、胃癌是我國常見的惡性腫瘤，胃癌的發(fā)生是一個多因素、多階段的過程，從正常胃粘膜到胃癌的發(fā)生要經(jīng)歷一個長期演變過程。即從正常胃粘膜-淺表性胃炎-萎縮性胃炎-腸上皮化生-異型增生-胃癌的觀點。慢性萎縮性胃炎是一種臨床常見病，在病理上常伴有腸上皮化生和不典型增生，尤其是伴有不典型增生，有較高的惡變率，它們與胃癌的關(guān)系密切，被稱為胃癌前病變，胃癌前病變存在胃粘膜上皮細(xì)胞增殖異常，也存在細(xì)胞凋亡的異常，是細(xì)胞增殖和凋亡失衡。隨著胃粘膜病變程度的加重

2、，細(xì)胞凋亡減少而增殖逐漸遞增，增加了胃粘膜細(xì)胞惡變的機會。細(xì)胞凋亡減少是造成胃粘膜不典型增生的主要原因。在治療上，目前對中藥治療胃癌前病變研究很多。慢性萎縮性胃炎伴不典型增生在中醫(yī)屬于“胃脘痛”等范疇，病程比較長，往往由氣及血，造成血液運行失常，瘀血貫穿疾病的始終，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為脾虛血瘀是其基本病機，通過健脾化瘀治療能影響胃粘膜細(xì)胞的增殖和凋亡水平。
　　 線粒體是細(xì)胞生命活動調(diào)控中心，也是細(xì)胞凋亡的調(diào)控中心，很多因素通過線粒體來

3、激活細(xì)胞凋亡途徑。目前從線粒體途徑研究胃癌前病變細(xì)胞凋亡機制的比較少，本研究以胃癌前病變的病因病機為基礎(chǔ)，通過有關(guān)指標(biāo)的檢測，探討從線粒體途徑研究健脾、化瘀、健脾化瘀中藥對胃癌前病變療效的的異同，推論不同中藥的組方特點，及對細(xì)胞凋亡的影響，為胃癌的防治提供思路。
　　 目的：
　　 1通過分析慢性萎縮性胃炎伴不典型增生的發(fā)病機制，探討胃癌前病變與細(xì)胞凋亡的關(guān)系。
　　 2通過外源性化學(xué)刺激及飲食失常建立大鼠胃癌前

4、病變模型，并對該病因病機作一探討。
　　 3通過健脾、化瘀、健脾化瘀三種不同中藥及西藥的應(yīng)用，觀察它們從線粒體通路對于胃癌前病變大鼠細(xì)胞凋亡的不同效應(yīng)機制。
　　 材料與方法：
　　 1動物及造模：實驗動物選用普通級健康wister大鼠120只，雌雄各半，體重160±5g，隨機分為11組，分別為中、西藥預(yù)防和治療組、造模對照組、正常組。采用饑飽失常、灌服水楊酸鈉、熱鹽水、飲用脫氧膽酸鈉等綜合方法制作慢性萎縮性胃炎

5、伴不典型增生大鼠模型。采用健脾、化瘀、健脾化瘀進行預(yù)防和治療用藥。
　　 2中藥方藥組成：益氣健脾中藥：黨參15 g、白術(shù)15 g、黃芪15 g；化瘀中藥：丹參15 g、三七3 g、莪術(shù)15 g；健脾化瘀中藥：黨參15 g、白術(shù)15 g、黃芪15 g、丹參15 g、三七3 g、莪術(shù)15 g購自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥局，按沖劑制備工藝將每種藥液煎煮提取兩次，調(diào)整藥液濃度健脾化瘀為每1ml含生藥1g，健脾組、化瘀組為每1ml含生藥

6、0.5g，由遼寧中醫(yī)學(xué)院附屬制劑室提供。維酶素研末加蒸餾水配成0.1g/ml的混懸液。
　　 試劑：兔抗人P53單克隆抗體及二抗購自武漢博士得微生物有限責(zé)任公司，Rhodamine123、CytochromeC抗體試劑盒、山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗、Caspase-9活性檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司。
　　 3取材：取胃竇部組織標(biāo)本-部分置于10％多聚甲醛溶液固定，另一部分放于-70℃冰箱保存，一部分立即制成單細(xì)

7、胞懸液。
　　 4病理標(biāo)本石蠟包埋、切片、臟染色，用流氏細(xì)胞儀檢測胃粘膜上皮細(xì)胞線粒體膜電位和細(xì)胞色素C的變化，用western blotting免疫印記法測定胃粘膜P53蛋白的表達，用化學(xué)比色法檢測胃癌前病變大鼠胃粘膜上皮細(xì)胞caspase9的活性。
　　 結(jié)果：
　　 1論文第一部分結(jié)果：正常組大鼠體態(tài)、飲食如常，身體健壯，體重自然增加；模型組大鼠精神萎靡，消瘦，懶于活動，食欲下降。中、西藥預(yù)防和治療各組，上

8、述癥狀較模型組輕。病理圖片顯示，預(yù)防用藥組：造模組不典型增生發(fā)病率為100％，且主要集中在中、重度異型增生，中度為4例、重度6例，無正常胃粘膜及輕度不典型增生；健脾中藥組在正常胃粘膜，輕、中、重度不典型增生的例數(shù)為分別為2例、4例、1例、0例；化瘀中藥組分別為3例、3例、3例、0例；健脾化瘀中藥組分別為7例、1例、0例、0例；西藥組分別為3例、3例、2例、0例；健脾中藥組和化瘀中藥組、健脾化瘀中藥組、西藥組的不典型增生發(fā)病率分別為（71

9、.4％、66.6％、12.5％、62.5％），多發(fā)生在輕度不典型增生，無重度異型增生發(fā)生。健脾預(yù)防組、化淤預(yù)防組、健脾化淤預(yù)防組、西藥預(yù)防組輕度不典型增生的發(fā)病率分別為（80％、50％、100％、60％）。中、西藥預(yù)防組和造模組有差異（P<0.05）；治療用藥組：造?？瞻捉M多集中在中、重度不典型增生，分別為中度2例、重度6例，發(fā)病率為100％，無正常胃粘膜及輕度不典型增生，健脾中藥組在正常胃粘膜，輕、中、重度不典型增生的例數(shù)分別為1例、

10、5例、3例、0例；化瘀中藥組分別為1例、5例、4例、0例；健脾化瘀中藥組分別為6例、2例、0例、0例）；西藥組分別為2例、3例、3例、0例，健脾中藥組、化瘀中藥組、健脾化瘀中藥組、西藥組的不典型增生發(fā)病率分別為（88.9％、90％、25％、75％），多發(fā)生在輕度不典型增生，輕度不典型增生分別為（62.5％、55.6％、100％、50％）。中、西藥治療組與造?？瞻捉M比較有差異（P<0.05）。
　　 2論文第二部分結(jié)果：大鼠胃粘膜

11、細(xì)胞P53測定情況，預(yù)防組：造模組比較正常組P53表達增強（P<0.01），健脾中藥、化瘀中藥、健脾化瘀中藥和西藥預(yù)防用藥，與造模組比較P53表達下降（P<0.01），中藥比西藥明顯下降（P<0.01），健脾化瘀中藥較健脾中藥、化瘀中藥明顯下降（P<0.05或P<0.01）。治療組：造?？瞻捉MP53的表達較正常組P53表達增強（P<0.01），三組中藥和西藥與造模組比較P53表達下降（P<0.01），健脾化瘀中藥較健脾中藥、化瘀中藥、西

12、藥明顯下降（P<0.01）。健脾組、化瘀組作用相似（P>0.05），
　　 3論文第三部分結(jié)果：大鼠胃粘膜細(xì)胞線粒體膜電位和細(xì)胞色素C測定情況，對于膜電位（△ψm），預(yù)防組和治療組中造模組、造?？瞻捉M高于正常組（P<0.05），健脾、化瘀、健脾化瘀、西藥組預(yù)防和治療用藥后較造模組明顯下降（P<0.05），較正常組高（P<0.05），健脾化瘀組較健脾組、化瘀組、西藥組明顯減低（P<0.05），健脾組、化瘀組作用相似（P>0.05）

13、，健脾組、化瘀組與西藥組作用相似（P>0.05）。對于細(xì)胞色素C，造模組、造?？瞻捉M較正常組明顯減低（P<0.05），預(yù)防組和治療組中健脾、化瘀、健脾化瘀、西藥組較造模組、造?？瞻捉M明顯升高（P<0.05），健脾化瘀組較健脾組、化瘀組、西藥組明顯升高（P<0.05），健脾組、化瘀組作用相似（P>0.05），健脾組、化瘀組與西藥組作用相似（P>0.05）。
　　 4論文第四部分結(jié)果：大鼠胃粘膜細(xì)胞caspase9的測定情況，造模組

14、、造模空白組較正常組明顯減低（P<0.05），經(jīng)過預(yù)防用藥或治療用藥，健脾、化瘀、健脾化瘀、西藥組較造模組或造?？瞻捉M明顯升高（P<0.05），健脾、化瘀、西藥明顯低于正常組（P<0.05），健脾化瘀組與健脾組、化瘀組、西藥組比較明顯升高（P<0.05），健脾、化瘀中藥組之間及健脾、化瘀與西藥組比較相似（P>0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1胃癌前病變存在細(xì)胞凋亡、增殖失衡。
　　 2胃癌前病變存在P53表達增

15、強，細(xì)胞凋亡減少。
　　 3胃癌前病變線粒體膜電位下降減少，細(xì)胞色素C釋放減少，細(xì)胞凋亡減少。
　　 4胃癌前病變胃粘膜上皮細(xì)胞caspase-9活性的下降，細(xì)胞凋亡減少。
　　 5健脾、化瘀、健脾化瘀中藥對胃癌前病變P53的表達具有抑制和下調(diào)作用。
　　 6健脾、化瘀、健脾化瘀中藥能通過降低胃癌前病變胃粘膜上皮細(xì)胞線粒體膜電位，促進細(xì)胞色素C的釋放增加，參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控。
　　 7健脾、化瘀、