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文檔簡介
1、目的:牙菌斑生物膜是齲病發(fā)生的基礎(chǔ)。變異鏈球菌、表兄鏈球菌和內(nèi)氏放線菌等是構(gòu)成牙菌斑生物膜的主要致齲菌。細菌通過疏水作用吸附于牙釉質(zhì)表面的獲得性膜,利用葡糖基轉(zhuǎn)移酶催化基質(zhì)中的蔗糖合成葡聚糖,葡聚糖可誘導牙面上細菌的粘附和聚集,促進牙菌斑形成。牙菌斑中的細菌代謝產(chǎn)酸,主要是無氧酵解中乳酸脫氫酶催化丙酮酸生成乳酸,酸的累積造成牙釉質(zhì)的局部脫礦,導致齲損形成。本課題組在國內(nèi)外首先開展檸檬提取物(Lemonpeelextract,LPE)防齲
2、的系列研究,LPE是由水果檸檬中提取的一種淡黃色液體,主要成分是檸檬烯及其同分異構(gòu)體(占總含量的79%)。本實驗通過研究LPE對5種致齲菌(變異鏈球菌、血鏈球菌、表兄鏈球菌、內(nèi)氏放線菌、嗜酸乳桿菌)的生長抑制作用,對表兄鏈球菌致齲相關(guān)酶(葡糖基轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶)的活性及代謝產(chǎn)物(水不溶性多糖)的抑制作用,探討LPE抑制口腔致齲菌生長,抑制表兄鏈球菌的附著性、代謝產(chǎn)酸的作用機制,同時分析代謝酶在細菌致齲作用中的意義。
方法:<
3、br> 1.LPE提取及成分分析
采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油,在一定的色譜質(zhì)譜條件下,測得檸檬揮發(fā)油成分GC-MS總離子流色譜圖(TIC)。根據(jù)檢索NIST2008譜庫,按峰面積歸一化法進行定量,求得各組分的相對含量。
2.LPE對五種口腔致齲菌生長的影響
本實驗選取變異鏈球菌、表兄鏈球菌、嗜酸乳桿菌、血鏈球菌、內(nèi)氏放線菌為實驗菌株,采用液體稀釋法測定最小抑菌濃度(minimalinhibitorycon
4、centration,MIC);根據(jù)MIC實驗結(jié)果,配置含LPE的TPY液體培養(yǎng)基。將菌懸液(1×108CFU/ml)與TPY液體培養(yǎng)基按體積比1:10比例接種,置于恒溫細菌培養(yǎng)箱中37℃厭氧培養(yǎng)。分別于0h、0.5h、1h、2h、4h、6h、18h、24h提取菌液,采用菌落計數(shù)法檢測LPE對五種細菌生長的影響。以活菌數(shù)(lgCFU/ml)為縱坐標,時間為橫坐標,作圖繪制生長曲線。
3.LPE對表兄鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性和細胞
5、外不溶性多糖含量的影響采用二倍稀釋法,用TPY液體培養(yǎng)基將LPE稀釋為2.25mg/ml、1.125mg/ml、0.563mg/ml和0.28mg/ml4個濃度的溶液(MIC為4.5mg/ml),以TPY液體培養(yǎng)基作為空白對照組。采用菌落計數(shù)法檢測MIC以下四個濃度LPE對表兄鏈球菌生長曲線的影響。用Neson-Somogyi法測定培養(yǎng)6h、18h、24h和48h培養(yǎng)液中還原糖的含量,計算出葡糖基轉(zhuǎn)移酶(Glucosyltransfer
6、ase,GTF)活性;采用蒽酮法測定水不溶性多糖(Waterinsolubleglucan,WIG)的含量,并對GTF活性與WIG含量的關(guān)系做相關(guān)性分析。
4.LPE對表兄鏈球菌乳酸脫氫酶活性和產(chǎn)酸的影響
分組設(shè)計同上。采用還原性輔酶I氧化法,測定LPE對表兄鏈球菌乳酸脫氫酶(Lactatedehydrogenase,LDH)活性的影響,同時用FE20實驗室pH計測定用藥前后培養(yǎng)液中pH值的變化(△pH=初始pH值-
7、終末pH值),以檢測LPE對表兄鏈球菌產(chǎn)酸能力的抑制作用,并對LDH活性和細菌代謝產(chǎn)酸能力的關(guān)系做相關(guān)性分析。
結(jié)果:
1.從檸檬提取物氣相色譜-質(zhì)譜總離子流色譜圖(TIC)中,共檢測出100余個色譜峰,鑒定了其中的40個色譜峰,其含量占揮發(fā)油總量的93.954%。主要成分是檸檬烯,β-蒎烯,4-皆烯等。
2.LPE對五種口腔致齲菌的MIC分別是:變異鏈球菌、血鏈球菌、表兄鏈球菌的MIC為4.5mg/ml,
8、嗜酸乳桿菌和內(nèi)氏放線菌的MIC為2.25mg/ml。在致齲菌的MIC作用下,從0.5h到2.4h,隨作用時間延長,實驗組菌量逐漸減少。選取0、0.5h、1h、2h四個時點,對各菌組的實驗組與空白對照組進行重復測量方差分析,變異鏈球菌、血鏈球菌、內(nèi)氏放線菌、嗜酸乳桿菌、表兄鏈球菌的實驗組與空白組比較,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。
3.菌落計數(shù)法測量MIC以下四個濃度LPE對表兄鏈球菌生長的影響。從0.281mg/ml組到2
9、.25mg/ml組,隨著LPE溶液濃度的升高,在0h、0.5h、1h、2h、4h、6h、18h、24h、48h,與空白對照組比較,LPE對表兄鏈球菌的生長有抑制作用。在同一時間點,隨著LPE溶液濃度的升高,表兄鏈球菌的GTF活性及胞外WIG含量逐漸降低,除低濃度組0.563mg/ml和0.281mg/ml外,各組還原糖量及酶活性均數(shù)間比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01);各濃度組與空白對照組GTF活性及WIG勻數(shù)之間比較,差異均有統(tǒng)
10、計學意義(P<0.01);同一濃度下,各時間點(48h除外)(濃度組-空白對照組)酶活性與WIG含量的總體均數(shù)比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01),空白對照組酶活性的總體均數(shù)在6h、18h與24h間比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)??瞻讓φ战MWIG含量的總體均數(shù)在4個時間點比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。GTF活性和WIG含量之間呈正相關(guān)(r=0.865~0.94)。
4.在同一時間點,隨著LPE溶液濃度
11、的升高,從0.281mg/ml組到2.25mg/ml組,LDH活性和△pH逐漸降低,各實驗組均數(shù)間比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),各實驗組與空白對照組酶活性、△pH比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01);同一濃度下,各時間點,(濃度組-空白對照組)乳酸脫氫酶活性和△pH的總體均數(shù)在四個時間點間比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。乳酸脫氫酶活性和△pH值之間呈正相關(guān)(r=0.926~0.982)。
結(jié)論:
12、 1.本研究提取并使用的LPE,主要成分以烯類化合物為主,占總含量79%,主要有:檸檬烯(48%)、β-蒎烯(17%)等。
2.LPE對變異鏈球菌(MIC4.5mg/ml)、血鏈球菌(MIC4.5mg/ml)、表兄鏈球菌(MIC4.5mg/ml)、內(nèi)氏放線菌(MIC2.5mg/ml)、嗜酸乳桿菌(MIC2.5mg/ml)的生長有抑制作用。
3.LPE在MIC以下四個濃度,從0.281mg/ml至2.25mg/ml,
13、對表兄鏈球菌GTF和WIG的合成均具有抑制作用,隨著藥物濃度的升高,抑制作用增強。
4.LPE在MIC以下四個濃度,從0.281mg/ml至2.25mg/ml,對表兄鏈球菌LDH活性及影響糖代謝產(chǎn)酸能力均具有抑制作用,隨著藥物濃度的升高,抑制作用增強。
5.LPE對表兄鏈球菌GTF和WIG合成的抑制作用最佳時間段為18h~24h。
6.LPE在低于MIC以下的四個濃度(0.281mg/ml、0.563mg/
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