DFI體內(nèi)篩選肺炎鏈球菌致腦膜炎相關(guān)基因.pdf

1、盡管抗生素治療已取得了長足的進步，細菌性腦膜炎仍是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生最頻繁，最嚴重的感染性疾病，其比例至少占腦膜炎總數(shù)的60％以上。引起細菌性腦膜炎最常見的三種病原菌依次為流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌和腦膜炎奈瑟菌。目前對于肺炎鏈球菌(streptococcuspneumoniae，S.pn)引起腦膜炎的機制并未完全清楚，因此發(fā)現(xiàn)S.pn致腦膜炎相關(guān)的毒力基因，不僅有助于進一步理解其致病機理，還可為新藥開發(fā)和研發(fā)新型蛋白類疫苗提供候選基因。

2、 細菌進入宿主體內(nèi)就如同進入一個生存競爭的“戰(zhàn)場”，要在體內(nèi)生存就必須表達一些使自身毒力增強或?qū)λ拗鲹p傷加劇的基因，因此細菌在宿主體內(nèi)表達的基因往往就是與致病緊密相關(guān)的毒力基因。本研究利用小鼠腦膜炎模型和差異熒光誘導技術(shù)(differential fluorescenceinduction，DFI)，在體內(nèi)大規(guī)模地篩選鑒定在肺炎鏈球菌性腦膜炎感染過程中表達或表達增強的基因，這些基因很可能就是肺炎鏈球菌引起腦膜炎的相關(guān)基因，在很大程

3、度上影響著肺炎鏈球菌通過血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)的侵襲力。研究內(nèi)容包括以下四個部分。 1．肺炎鏈球菌性腦膜炎動物模型的建立。將凍存的TIGR4在新鮮TSA血平板上培養(yǎng)16～18h后，刮取細菌并稀釋成三種不同密度的菌液，每種密度分成2份，其中一份加入一定量的透明質(zhì)酸酶，另一份不加。對小鼠行淺麻醉，用卡介苗注射器將上述菌懸液緩緩逐滴滴至小鼠鼻腔處，待其自動吸入，每只小鼠50μl。每天觀察小鼠情況，于

4、感染后24h、48h和72h處死小鼠，取心臟血和一半腦組織勻漿做細菌計數(shù)，另一半腦組織用于組織病理學檢查。結(jié)果表明：①透明質(zhì)酸酶并不能促進鼻腔滴注TIGR4致小鼠腦膜炎的發(fā)生；②小鼠腦膜炎的發(fā)生率與鼻腔感染TIGR4劑量有關(guān)，3×10<'7>CFU已足夠，但低于該劑量腦膜炎的發(fā)生率會大大降低；③小鼠嗜睡、弓背癥狀與腦組織病理學改變顯著相關(guān)。模擬S.pn在人類感染途徑，通過鼻腔滴注TIGR4．成功建立了小鼠腦膜炎模型，并且證實小鼠可出現(xiàn)嗜

5、睡、弓背等腦膜炎典型癥狀，為下一步研究S.pn致腦膜炎的分子機制奠定了基礎(chǔ)。 2．肺炎鏈球菌綠色熒光蛋白報告質(zhì)粒的構(gòu)建及評價。DFI是以綠色熒光蛋白(GFP)為報告基因的篩選病原菌體內(nèi)誘導基因的技術(shù)，必須要構(gòu)建一個可高效報告基因表達的綠色熒光蛋白報告質(zhì)粒。質(zhì)粒pGreeffrIR含有SD序列和翻譯增強子ENH及無啟動子的增強型綠色熒光蛋白基因(gfp)，將其中的SD-ENH-GFP片段經(jīng)BamH Ⅰ酶切后插入含氯霉素抗性基因的自

6、殺質(zhì)粒pEVP3中，構(gòu)建了以綠色熒光蛋白為報告基因的自殺質(zhì)粒pEVP3-SDGFP。為了評價新建質(zhì)粒pEVP3-SDGFP報告上游基因表達的情況，我們將肺炎鏈球菌的溶血素基因(pneumolysin，ply)上游約500bp片段插入到該質(zhì)粒報告基因上游的多克隆位點中，得到質(zhì)粒pEVP3-SDGFP-Ply，將其轉(zhuǎn)化入肺炎鏈球菌TIGR4中，由于溶血素基因在體內(nèi)、外均可表達，通過體內(nèi)、外實驗證實其不但可以報告肺炎鏈球菌溶血素基因的表達，并

7、且比已有質(zhì)粒pEGFP-1報告上游基因表達的能力顯著增強。表明構(gòu)建的肺炎鏈球菌綠色熒光蛋白報告質(zhì)粒pEVP3-SDGFP可以用于DFI篩選肺炎鏈球菌腦組織內(nèi)誘導基因所需的啟動子誘捕文庫的構(gòu)建。 3．肺炎鏈球菌啟動子誘捕文庫的構(gòu)建與初步分析。用DFI篩選病原菌體內(nèi)誘導的基因，首先要構(gòu)建一個包含無啟動子序列的報告基因的啟動子誘捕文庫。以第一部分構(gòu)建的自殺質(zhì)粒pEVP3-SDGFP為骨架，將Sau3AI酶切的肺炎鏈球菌基因組DNA隨機

8、片段(200～800bp)克隆到此載體GFP基因上游的BglⅡ位點，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得了約58 000個重組子，提取質(zhì)粒，即為含有肺炎鏈球菌基因組DNA隨機酶切片段的質(zhì)粒庫?？紤]到DNA片段的插入方向和大小(200～800bp，平均400bp)，該質(zhì)粒庫大約覆蓋肺炎鏈球菌基因組全長(2.2Mb)的5倍，插入率達到90％以上，且有較強的隨機性，質(zhì)量較高。將該質(zhì)粒庫轉(zhuǎn)化入肺炎鏈球菌TiGR4菌株，獲得包含約500 000個

9、肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化子的菌株庫。經(jīng)過體內(nèi)和體外實驗表明，其包含插入了S.pn體內(nèi)、外表達基因片段的細菌，可以報告在特定條件下的基因表達，并且可通過流式細胞儀識別、分選。該文庫的成功構(gòu)建為進一步利用差異熒光誘導技術(shù)篩選肺炎鏈球菌腦組織內(nèi)誘導基因奠定了良好的基礎(chǔ)。 4．小鼠腦組織中誘導表達的S.pn基因的篩選及生物信息學分析。將構(gòu)建好的肺炎鏈球菌菌株庫鼻腔滴注感染BALB/c小鼠，出現(xiàn)嗜睡、弓背等腦膜炎癥狀后取小鼠腦組織，勻漿，流式細胞儀

10、分選(fluorescence-activated cell sirting，F(xiàn)ACS)收集腦組織內(nèi)有熒光的細菌，體外培養(yǎng)一定時間后，再用流式細胞分選術(shù)剔除那些在體外也表達熒光的細菌，收集無熒光表達的細菌，得到只在腦組織內(nèi)發(fā)熒光的細菌，經(jīng)過兩輪篩選，最后我們共挑取220個菌落進行進一步分析。為了克隆這些細菌中包含的腦組織內(nèi)誘導基因的片段，我們應(yīng)用酶切自連法，即提取這些菌株的染色體DNA，用BamHⅠ酶切，并自身環(huán)化，使整合到染色體上的重

11、組自殺質(zhì)粒脫落下來并重新環(huán)化。對插入的隨機片段進行測序后進行生物信息學分析，共證實有24個不同的基因片段，在TIGR4全基因組里面，這24個基因片段所處的操縱元結(jié)構(gòu)中，總共包括51個開放閱讀框，其中多數(shù)為含有多個ORFs的操縱元結(jié)構(gòu)。這些基因包括參與氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝、碳水化合物轉(zhuǎn)運和代謝、DNA復(fù)制與重組、細胞壁合成、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、離子攝取以及功能未知的基因，其中有些基因的功能已有一些初步的研究，但其在腦膜炎發(fā)生過程中的作用并不清楚，如cb