栽培稻及疣粒野生稻中Xa5等位基因的功能研究.pdf

1、水稻白葉枯病是由黃單胞水稻變種引起的細菌性維管束病害，嚴重影響著水稻的產(chǎn)量和品質。挖掘新的抗性基因，培育新的抗病品種是目前控制病害發(fā)生最經(jīng)濟有效的措施。
　　對植物抗性基因的研究一直以來是植物分子生物學領域的熱點，迄今從不同宿主中分離出的多個抗性基因中僅有少部分為隱性抗性基因，這些隱性抗性基因的具體作用機理目前尚不能用廣為接受的顯性抗性基因的作用機理來進行解釋。
　　從水稻中已鑒定出了38個主效抗白葉枯病基因，已被定位的有2

2、7個，其中僅有5個為隱性抗性基因。位于第5號染色體短臂的xa5是其中典型的一個隱性抗性基因，編碼轉錄因子ⅡAγ小亞基，和其它顯性或者隱性抗白葉枯病基因存在抗性互作，基因結構和其它典型抗性基因的結構都不一樣，說明了xa5基因抗病機理的特異性。
　　xa5的序列在水稻抗病品種和感病品種中有兩個堿基的差異導致了纈氨酸突變成谷氨酸，而且該突變的氨基酸位點位于蛋白三維結構的表面，可能與蛋白的互作相關。
　　1.OsXa5和OmXa5基

3、因的表達特性
　　分別構建OsXa5和OmXa5基因的亞細胞定位的載體和自身互作載體，通過農(nóng)桿菌共浸潤的方法，在煙草體細胞中觀察到OsXa5和OmXa5均為核內定位的基因，未觀察到兩者存在自身互作的現(xiàn)象。為進一步了解基因在水稻植株中的表達，分別取野生型石狩白毛4個不同生育期的根、莖和葉片，通過半定量PCR檢測基因出基因在水稻的全生育期均有表達，且以在最大分蘗期的葉片中表達量最大。水稻野生型石狩白毛2h和24 h后通過半定量PCR檢

4、測基因的表達情況。發(fā)現(xiàn)兩個不同處理時間段基因的表達量差異不顯著。但在乙烯、干旱和高溫脅迫處理水稻植株24 h后，基因的表達量與2h的處理組相比略有變化，推測OsXa5基因可能參與了植物體應對乙烯和干旱脅迫的應答途徑，且基因的表達還受到高溫脅迫的影響。
　　2.OsXa5和OmXa5抗病性鑒定及轉錄組研究
　　超表達目的基因并通過基因工程將其導入水稻等模式作物中已成為研究基因功能的重要方法。將OsXa5和OmXa5基因超表達后

5、，利用農(nóng)桿菌介導法轉入野生型石狩白毛的愈傷組織中，借助PCR檢測法和卡方檢驗篩選獲得OsXa5和OmXa5的純合超表達水稻植株OsXa5-OE和OmXa5-OE。
　　對超表達植株種子的萌發(fā)狀況進行觀察發(fā)現(xiàn)，與野生型石狩白毛相比，OsXa5-OE的種子萌發(fā)率的差異不顯著，而OmXa5-OE種子的萌發(fā)率較低;對生理表型特征的觀察，發(fā)現(xiàn)OsXa5-OE平均每株苗的葉片數(shù)目較少，OmXa5-OE平均每株苗的葉片數(shù)目較多，且OsXa5-O

6、E比OmXa5-OE較早出現(xiàn)衰老的葉片。OsXa5-OE和OmXa5-OE的分蘗數(shù)目少于野生型石狩白毛，OsXa5-OE的莖干長度、初生根和次生根的長度均明顯小于野生型石狩白毛和OmXa5-OE。通過對水稻植株的結實率和千粒重的測定，對照組野生型石狩白毛的結實率顯著高于轉基因水稻植株OsXa5-OE和OmXa5-OE，且OsXa5-OE的結實率顯著高于OmXa5-OE，但三者的千粒重差異不顯著。超表達OsXa5基因能夠導致水稻植株的矮化

7、，推測可能是由于轉基因水稻植株體內的矮桿主效基因作用的結果，也可能是受到赤霉素和油菜素類固醇等植物生長調劑的影響。超表達OmXa5基因使水稻植株種子的結實率顯著下降，推測可能是由于OmXa5基因來源于疣粒野生稻，一定程度上保留了疣粒野生稻的性狀，具體原因尚未明確。未發(fā)現(xiàn)超表達OsXa5和OmXa5基因對水稻植株的正常生長發(fā)育有明顯的影響。
　　為研究超表達OsXa5和OmXa5基因的植株對病原菌抗性的影響，在植株的最大分蘗期通過剪

8、葉法接種病原菌黃單胞水稻變種菲律賓生理小種PXO99，PXO280和PXO341。對病斑的延伸情況進行觀察并在接菌21 d后測量并統(tǒng)計病斑長度。通過對病斑長度的測量發(fā)現(xiàn)病原菌黃單胞水稻變種菲律賓菌株PXO99，PXO280和PXO341對OsXa5-OE和OmXa5-OE均存在致病性，且三個小種間的致病性存在差異，以菲律賓菌株PXO99的致病性最強，PXO341的致病性最弱。與對照組野生型石狩白毛相比超表達OsXa5在一定程度上改變了植

9、物體對病原菌黃單胞水稻變種的抗性，而超表達OmXa5能夠提升植株對病原菌黃單胞水稻變種的抗性，具有潛在的應用價值。利用基因芯片技術篩選到OsXa5-OE中與野生型石狩白毛相比的有188個差異表達基因并通過定量PCR的驗證。在篩選獲得的差異表達基因中，有139個基因呈上調表達的趨勢，49個基因呈下調表達的趨勢，其中包含WRKY家族基因，細胞色素P450家族基因，與泛素相關的基因，與乙烯信號途徑相關的基因和過氧化物酶類的基因等。說明OsXa

10、5基因在植物體的防御反應信號途徑中是一個重要的效應因子。參與了植物體中的多種信號途徑。
　　3.OsXa5和OmXa5互作因子的篩選驗證
　　為進一步了解OsXa5和OmXa5的互作因子，構建了水稻酵母雙雜交cDNA文庫，并對文庫質量進行了檢測，符合篩庫的標準。分別以OsXa5和OmXa5作為酵母雙雜交誘餌蛋白，自激活實驗表明，OsXa5和OmXa5對酵母菌株MaV203的生長沒有毒性，3AT的濃度均為25 mM。通過共轉法

11、從水稻cDNA文庫中篩選互作的因子，初步篩選獲得了73個與OsXa5存在潛在互作的陽性克隆，59個與OmXa5存在潛在互作的陽性克隆。通過序列的比對分析以及雙分子熒光互補技術的驗證。共篩選獲得了4個與OsXa5互作的因子，分別是類似的組蛋白H2A.2.1(Os05g0461400)，類似泛素(Os09g0420800)，類似的光系統(tǒng)Ⅱ放氧復合蛋白1(Os01g0501800)和過氧化氫酶同工酶(Os02g0115700)。3個與OmXa

12、5互作的因子，分別是類似光系統(tǒng)Ⅱ10 kDa多肽(Os07g0147500)、類似捕光復合物Ⅰ(Os06g0320500)和類似谷胱甘肽-S-轉移酶Cla47(Os10g0530500)。從體內互作層面上證實OsXa5參與了植物體內的多種抗逆信號途徑。OmXa5與光合作用途徑中的一個類似效應因子互作，表明OmXa5可能與光合作用介導的信號途徑相關，同時參與谷胱甘肽過氧化物酶防御ROS的過程，介導了植物體抗病反應的發(fā)生。
　　4.O

13、sXa5和OmXa5的原核表達及GST Pull-Down
　　由于酵母雙雜交技術和雙分子熒光互補技術均是在生物體內驗證因子間的相互作用關系，而在體外是否互作還尚未知曉，因而通過構建OsXa5和OmXa5帶有GST標簽的融合蛋白，利用L-Arabinose和IPTG在低溫條件下誘導融合蛋白在上清中的表達，并粗提水稻野生型石狩白毛的愈傷總蛋白，進行GST Pull-Down實驗，通過SDS-PAGE的檢測找出差異條帶，割膠回收后進行