高危型人乳頭瘤病毒早期蛋白E6和E7調(diào)控細(xì)胞周期的機(jī)制研究.pdf

1、人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)是小雙鏈DNA病毒,基因組長約8kb,該病毒具有高度的嗜上皮性和組織特異性。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)150多種HPV型別,其中感染生殖道的HPV根據(jù)其致病性,可分為低危型HPV和高危型HPV。低危型如HPV6,11等可引起尖銳濕疣等良性病變,而高危型如HPV16,18等可誘導(dǎo)宮頸癌等癌癥的發(fā)生。
　　 流行病學(xué)研究表明,HPV16和HPV18誘發(fā)的宮頸癌占所有HPV陽性宮頸癌的

2、70％左右,其中HPV16感染在全球具有明顯主導(dǎo)作用,具有致癌危險(xiǎn)性的除了HPV16和HPV18以外,還有31,33,45與58型等,其中58型人乳頭瘤病毒的流行具有明顯的地區(qū)特異性,HPV58是亞洲地區(qū)引發(fā)宮頸癌的第三大HPV型別,僅次于HPV16,18。HPV58在中國女性宮頸癌標(biāo)本中的檢出陽性率非常高,尤其是中國南部城市和臺(tái)灣、香港等地,HPV58型的檢出率僅次于HPV16型,同時(shí)二者在宮頸各病變組的檢出強(qiáng)度趨勢基本一致。

3、　　 人乳頭瘤病毒基因組可分為三個(gè)區(qū):非編碼區(qū),編碼7個(gè)早期基因的早期區(qū)和編碼2個(gè)晚期基因的晚期。高危型HPV的致癌性主要依賴于早期蛋白E6和E7,其中E6結(jié)合并通過泛素途徑降解p53,而E7降解Rb蛋白,釋放Rb/E2F復(fù)合物中的轉(zhuǎn)錄因子E2F,E2F激活細(xì)胞合成所需蛋白的轉(zhuǎn)錄,從而引起細(xì)胞增殖的紊亂。我們的研究發(fā)現(xiàn):(一)HPV16E6還具備不依賴降解p53之外的其它功能,其在不降解p53的前提下,通過逃避有絲分裂后檢測點(diǎn)誘導(dǎo)多倍

4、體的產(chǎn)生,而多倍體是宮頸癌發(fā)生的重要早期事件；(二)我們首次在原代角化上皮細(xì)胞(primary humankeratinocytes,PHKs)中研究了HPV58E7的分子生物學(xué)活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其能降解Rb蛋白,并逃避抑制因子p21的抑制作用而激活細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent Enase,Cdk)2,從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖；(三)我們首次研究干擾素誘導(dǎo)蛋白(interferon-inducible protein,

5、IFI)16在宮頸癌中的作用,發(fā)現(xiàn)其能抑制宮頸癌細(xì)胞的生長增殖并抑制裸鼠體內(nèi)宮頸癌細(xì)胞所誘導(dǎo)的腫瘤生長,證實(shí)其可能是一種潛在的宮頸癌抑癌蛋白。
　　 一.HPV16 E6誘導(dǎo)多倍體的機(jī)制研究
　　 基因組不穩(wěn)定是癌癥發(fā)生發(fā)展的標(biāo)志之一。細(xì)胞含有兩套以上染色體即多倍體細(xì)胞在腫瘤的發(fā)展中具有重要意義。在許多癌癥中,多倍體是癌癥發(fā)生的早期事件,因?yàn)槎啾兜娜旧w將產(chǎn)生多極紡錘體,而之后的隨機(jī)分離將會(huì)產(chǎn)生異倍體。研究發(fā)現(xiàn),在宮頸癌

6、的早期能檢測到許多多倍體及異倍體細(xì)胞的存在,因此闡明HPV誘導(dǎo)多倍體的機(jī)制具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　 高危型人乳頭瘤病毒E6結(jié)合并通過泛素途徑降解p53是其致癌的主要原因,有報(bào)道稱HPV16E6通過逃避紡錘體聚集檢測點(diǎn)(spindle assembly checkpoint),誘導(dǎo)多倍體的產(chǎn)生,并且此功能依賴于E6降解p53,然而我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)16E6在不降解p53的前提下,也能誘導(dǎo)多倍體,并且16E6并沒有影響紡錘體聚集檢測點(diǎn)

7、,而是通過逃避有絲分裂后檢測點(diǎn)(post-mitotic checkpoint)實(shí)現(xiàn)的。
　　 1.為了明確16E6誘導(dǎo)多倍體是否依賴于其降解p53的功能,我們首先構(gòu)建了pBabe-HPV16E6及不能降解p53的16E6突變體pBabe-F2V,利用逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝系統(tǒng)包裝質(zhì)粒,獲得高滴度病毒顆粒,感染永生化的角化上皮細(xì)胞NIKS,嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定細(xì)胞系,Western blot鑒定16E6及F2V的功能性表達(dá)。我們用微管破

8、壞藥物nocodazole處理細(xì)胞,48h后觀察發(fā)現(xiàn)42％的PHK/16E6細(xì)胞變?yōu)槎啾扼w細(xì)胞,而20％的PHK/F2V也成為多倍體細(xì)胞,由于F2V不降解p53,說明16E6誘導(dǎo)多倍體的產(chǎn)生并不全是依賴降解p53實(shí)現(xiàn)的。
　　 2.用nocodazole處理細(xì)胞后,因?yàn)槲⒐鼙黄茐?紡錘體檢測點(diǎn)被激活。細(xì)胞首先經(jīng)歷紡錘體檢測點(diǎn)的檢測,然而我們的前期研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞并沒有停滯在M期,而是逐漸適應(yīng)這一過程,最后滑移到下一期-類G1期,由

9、于此期存在有絲分裂后檢測點(diǎn),空載體細(xì)胞將停滯在此期,而不會(huì)產(chǎn)生多倍體細(xì)胞,而NIKS/16E6及NIKS/F2V則可繞過這一檢測點(diǎn),產(chǎn)生多倍體細(xì)胞。目前對(duì)有絲分裂后檢測點(diǎn)的認(rèn)識(shí)尚不清晰,因?yàn)榧?xì)胞最終通過細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的作用完成各個(gè)細(xì)胞期,因此我們認(rèn)為NIKS/16E6及NIKS/F2V很可能通過激活某種Cdks順利通過此期,進(jìn)入合成期產(chǎn)生多倍體細(xì)胞。為了驗(yàn)證這一設(shè)想,我們首先檢測了細(xì)胞中一系列細(xì)胞周期蛋白及蛋白依賴激酶的表達(dá)水平

10、,結(jié)果表明Cdk1及Cdk2的表達(dá)顯著升高。
　　 3.在細(xì)胞周期中,Cdks的水平一般處于多余水平,只有Cdks與相應(yīng)的cyclins結(jié)合并磷酸化后,才具有激酶的活性,因此我們檢測了各種Cdks及cyclins的酶活性,結(jié)果證明Cdk1和Cdk2的活性都是升高的,說明Cdk1、Cdk2是推動(dòng)16E6表達(dá)細(xì)胞逃避有絲分裂后檢測點(diǎn),并產(chǎn)生多倍體細(xì)胞的決定因子。
　　 以上研究打破了現(xiàn)存的理論觀點(diǎn),闡明了16E6不依賴降解p

11、53之外的功能,豐富了16E6的致癌機(jī)制,同時(shí)進(jìn)一步拓寬了對(duì)有絲分裂后細(xì)胞周期檢測點(diǎn)的認(rèn)識(shí),為今后的臨床治療奠定了基礎(chǔ)。
　　 二.HPV58 E7致癌的分子機(jī)制研究
　　 人們對(duì)高危型HPV的研究主要集中在HPV16,18上,而對(duì)其它高危型HPV的研究較少。HPV58在亞洲地區(qū)包括中國在內(nèi)的宮頸癌中具有較高的檢出率,至今卻沒有對(duì)其轉(zhuǎn)化蛋白E7的生物活性的分子研究。
　　 1.我們首先利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建質(zhì)粒pB

12、abe-HPV58E7和pBabe-58E7-HA(haemagglutinin,HA)。為了更接近人體的自然感染狀態(tài),我們采用原代角化上皮細(xì)胞-HPV感染的天然宿主細(xì)胞為靶細(xì)胞,利用逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝系統(tǒng)獲得表達(dá)58E7的細(xì)胞系。RT-PCR確定58E7在mRNA水平的表達(dá),對(duì)HA的Western Blot檢測確定了HA在蛋白水平的表達(dá),間接證實(shí)58E7的表達(dá)。細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),與感染空載體的細(xì)胞相比,PHK/58E7細(xì)胞增殖顯著加快,并且空

13、載體原代角化細(xì)胞PHK/vector在第5代老化死亡,而PHK/58E7可生長至20代以上,實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞永生化。
　　 2.細(xì)胞周期依賴蛋白激酶是推動(dòng)細(xì)胞進(jìn)程、促進(jìn)細(xì)胞增殖的關(guān)鍵,而在一系列激酶中尤其以G1期相關(guān)激酶最為重要,因此我們檢測了G1期相關(guān)激酶Cdk2及其催化亞基cyclin A和cyclin E的表達(dá)水平,結(jié)果顯示PHK/58E7中Cdk2及cyclin A和cyclin E的表達(dá)顯著上調(diào),同時(shí)激酶活性分析證實(shí)Cdk2

14、的活性明顯提高。
　　 3.細(xì)胞周期分為G1,S,G2和M四期,在各期分別存在對(duì)應(yīng)的細(xì)胞周期檢測點(diǎn),當(dāng)細(xì)胞遭遇紫外線照射等DNA損傷時(shí),檢測點(diǎn)激活,細(xì)胞周期暫時(shí)停滯,直至修復(fù)完成才進(jìn)入下一周期。
　　 4.高危型HPVE7可以降解Rb蛋白,我們因此檢測58E7能否降解pRb及其家族產(chǎn)物p130和p107。
　　 三.IFI16抗HPV感染致富頸癌的作用及機(jī)制探討
　　 干擾素是一類具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化、

15、抗腫瘤及抗病毒等眾多生物學(xué)功能的小分子蛋白質(zhì),干擾素誘導(dǎo)蛋白(interferon-inducible proteins)是干擾素抗腫瘤抗病毒等眾多生物學(xué)功能的執(zhí)行者。其中p200蛋白家族是干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生的眾多蛋白質(zhì)的一類,而IFI16是p200家族的人源蛋白之一。
　　 1.我們首先檢測了IFI16在正常宮頸組織和宮頸癌組織中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)IFI16在宮頸癌中的表達(dá)顯著下調(diào)。為了進(jìn)一步研究IFI16在腫瘤形成過程中的作用,我們首

16、先在宮頸癌細(xì)胞系SiHa中過表達(dá)IFI16,進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)分析。MTT分析、細(xì)胞生長曲線表明過表達(dá)IFI16明顯降低細(xì)胞的生長率,流式細(xì)胞術(shù)表明進(jìn)入合成期細(xì)胞減少,β-細(xì)胞半乳糖苷酶分析顯示細(xì)胞衰老率增加。體外裸鼠腫瘤形成試驗(yàn)表明在宮頸癌細(xì)胞SiHa中過表達(dá)IFI16后,細(xì)胞的致瘤性降低,裸鼠體內(nèi)形成的腫瘤明顯縮小。
　　 2.另一方面我們利用RNAi(RNA interfere)技術(shù)構(gòu)建能有效降低細(xì)胞內(nèi)源性IFI16表達(dá)的質(zhì)

17、粒pSUPER-IFI16,將其轉(zhuǎn)染HPV永生化的H8細(xì)胞建立穩(wěn)定細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染pSUPER-IFI16的H8細(xì)胞細(xì)胞分裂增殖加快；同時(shí)進(jìn)入合成期的細(xì)胞增加。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pSUPER-IFI16的細(xì)胞分別皮下注射裸鼠,裸鼠體內(nèi)腫瘤形成的情況表明,注射對(duì)照細(xì)胞的裸鼠體內(nèi)沒有腫瘤形成;而當(dāng)抑制IFI16表達(dá),永生化細(xì)胞H8獲得了惡性轉(zhuǎn)化能力,注射穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pSUPER-IFI16細(xì)胞的6只裸鼠體內(nèi)均長出腫瘤。
　　 3.為了進(jìn)一步探討IF

18、I16影響宮頸癌的機(jī)制,我們分別研究了其對(duì)癌基因HPV16E6、16E7、myb、c-myc、抑癌基因Rb、p53,以及凋亡相關(guān)基因caspase3、caspase8的表達(dá)的影響。過表達(dá)IFI16后,我們發(fā)現(xiàn)HPV16E6、16E7、myb、c-myc、caspase3、caspase8基因的mRNA表達(dá)均下調(diào),而抑癌基因pRb和p53的mRNA表達(dá)則顯著增加。
　　 我們首次在細(xì)胞水平及動(dòng)物水平系統(tǒng)地研究了IFI16對(duì)宮頸癌的