高危型人乳頭瘤病毒早期蛋白E6和E7調控細胞周期的機制研究.pdf

1、人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)是小雙鏈DNA病毒,基因組長約8kb,該病毒具有高度的嗜上皮性和組織特異性。目前已經發(fā)現(xiàn)150多種HPV型別,其中感染生殖道的HPV根據其致病性,可分為低危型HPV和高危型HPV。低危型如HPV6,11等可引起尖銳濕疣等良性病變,而高危型如HPV16,18等可誘導宮頸癌等癌癥的發(fā)生。
　　 流行病學研究表明,HPV16和HPV18誘發(fā)的宮頸癌占所有HPV陽性宮頸癌的

2、70％左右,其中HPV16感染在全球具有明顯主導作用,具有致癌危險性的除了HPV16和HPV18以外,還有31,33,45與58型等,其中58型人乳頭瘤病毒的流行具有明顯的地區(qū)特異性,HPV58是亞洲地區(qū)引發(fā)宮頸癌的第三大HPV型別,僅次于HPV16,18。HPV58在中國女性宮頸癌標本中的檢出陽性率非常高,尤其是中國南部城市和臺灣、香港等地,HPV58型的檢出率僅次于HPV16型,同時二者在宮頸各病變組的檢出強度趨勢基本一致。

3、　　 人乳頭瘤病毒基因組可分為三個區(qū):非編碼區(qū),編碼7個早期基因的早期區(qū)和編碼2個晚期基因的晚期。高危型HPV的致癌性主要依賴于早期蛋白E6和E7,其中E6結合并通過泛素途徑降解p53,而E7降解Rb蛋白,釋放Rb/E2F復合物中的轉錄因子E2F,E2F激活細胞合成所需蛋白的轉錄,從而引起細胞增殖的紊亂。我們的研究發(fā)現(xiàn):(一)HPV16E6還具備不依賴降解p53之外的其它功能,其在不降解p53的前提下,通過逃避有絲分裂后檢測點誘導多倍

4、體的產生,而多倍體是宮頸癌發(fā)生的重要早期事件；(二)我們首次在原代角化上皮細胞(primary humankeratinocytes,PHKs)中研究了HPV58E7的分子生物學活性,結果發(fā)現(xiàn)其能降解Rb蛋白,并逃避抑制因子p21的抑制作用而激活細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent Enase,Cdk)2,從而促進細胞的增殖；(三)我們首次研究干擾素誘導蛋白(interferon-inducible protein,

5、IFI)16在宮頸癌中的作用,發(fā)現(xiàn)其能抑制宮頸癌細胞的生長增殖并抑制裸鼠體內宮頸癌細胞所誘導的腫瘤生長,證實其可能是一種潛在的宮頸癌抑癌蛋白。
　　 一.HPV16 E6誘導多倍體的機制研究
　　 基因組不穩(wěn)定是癌癥發(fā)生發(fā)展的標志之一。細胞含有兩套以上染色體即多倍體細胞在腫瘤的發(fā)展中具有重要意義。在許多癌癥中,多倍體是癌癥發(fā)生的早期事件,因為多倍的染色體將產生多極紡錘體,而之后的隨機分離將會產生異倍體。研究發(fā)現(xiàn),在宮頸癌

6、的早期能檢測到許多多倍體及異倍體細胞的存在,因此闡明HPV誘導多倍體的機制具有重要的現(xiàn)實意義。
　　 高危型人乳頭瘤病毒E6結合并通過泛素途徑降解p53是其致癌的主要原因,有報道稱HPV16E6通過逃避紡錘體聚集檢測點(spindle assembly checkpoint),誘導多倍體的產生,并且此功能依賴于E6降解p53,然而我們的實驗證實16E6在不降解p53的前提下,也能誘導多倍體,并且16E6并沒有影響紡錘體聚集檢測點

7、,而是通過逃避有絲分裂后檢測點(post-mitotic checkpoint)實現(xiàn)的。
　　 1.為了明確16E6誘導多倍體是否依賴于其降解p53的功能,我們首先構建了pBabe-HPV16E6及不能降解p53的16E6突變體pBabe-F2V,利用逆轉錄病毒包裝系統(tǒng)包裝質粒,獲得高滴度病毒顆粒,感染永生化的角化上皮細胞NIKS,嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定細胞系,Western blot鑒定16E6及F2V的功能性表達。我們用微管破

8、壞藥物nocodazole處理細胞,48h后觀察發(fā)現(xiàn)42％的PHK/16E6細胞變?yōu)槎啾扼w細胞,而20％的PHK/F2V也成為多倍體細胞,由于F2V不降解p53,說明16E6誘導多倍體的產生并不全是依賴降解p53實現(xiàn)的。
　　 2.用nocodazole處理細胞后,因為微管被破壞,紡錘體檢測點被激活。細胞首先經歷紡錘體檢測點的檢測,然而我們的前期研究發(fā)現(xiàn),細胞并沒有停滯在M期,而是逐漸適應這一過程,最后滑移到下一期-類G1期,由

9、于此期存在有絲分裂后檢測點,空載體細胞將停滯在此期,而不會產生多倍體細胞,而NIKS/16E6及NIKS/F2V則可繞過這一檢測點,產生多倍體細胞。目前對有絲分裂后檢測點的認識尚不清晰,因為細胞最終通過細胞周期蛋白依賴性激酶的作用完成各個細胞期,因此我們認為NIKS/16E6及NIKS/F2V很可能通過激活某種Cdks順利通過此期,進入合成期產生多倍體細胞。為了驗證這一設想,我們首先檢測了細胞中一系列細胞周期蛋白及蛋白依賴激酶的表達水平

10、,結果表明Cdk1及Cdk2的表達顯著升高。
　　 3.在細胞周期中,Cdks的水平一般處于多余水平,只有Cdks與相應的cyclins結合并磷酸化后,才具有激酶的活性,因此我們檢測了各種Cdks及cyclins的酶活性,結果證明Cdk1和Cdk2的活性都是升高的,說明Cdk1、Cdk2是推動16E6表達細胞逃避有絲分裂后檢測點,并產生多倍體細胞的決定因子。
　　 以上研究打破了現(xiàn)存的理論觀點,闡明了16E6不依賴降解p

11、53之外的功能,豐富了16E6的致癌機制,同時進一步拓寬了對有絲分裂后細胞周期檢測點的認識,為今后的臨床治療奠定了基礎。
　　 二.HPV58 E7致癌的分子機制研究
　　 人們對高危型HPV的研究主要集中在HPV16,18上,而對其它高危型HPV的研究較少。HPV58在亞洲地區(qū)包括中國在內的宮頸癌中具有較高的檢出率,至今卻沒有對其轉化蛋白E7的生物活性的分子研究。
　　 1.我們首先利用分子克隆技術構建質粒pB

12、abe-HPV58E7和pBabe-58E7-HA(haemagglutinin,HA)。為了更接近人體的自然感染狀態(tài),我們采用原代角化上皮細胞-HPV感染的天然宿主細胞為靶細胞,利用逆轉錄病毒包裝系統(tǒng)獲得表達58E7的細胞系。RT-PCR確定58E7在mRNA水平的表達,對HA的Western Blot檢測確定了HA在蛋白水平的表達,間接證實58E7的表達。細胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),與感染空載體的細胞相比,PHK/58E7細胞增殖顯著加快,并且空

13、載體原代角化細胞PHK/vector在第5代老化死亡,而PHK/58E7可生長至20代以上,實現(xiàn)了細胞永生化。
　　 2.細胞周期依賴蛋白激酶是推動細胞進程、促進細胞增殖的關鍵,而在一系列激酶中尤其以G1期相關激酶最為重要,因此我們檢測了G1期相關激酶Cdk2及其催化亞基cyclin A和cyclin E的表達水平,結果顯示PHK/58E7中Cdk2及cyclin A和cyclin E的表達顯著上調,同時激酶活性分析證實Cdk2

14、的活性明顯提高。
　　 3.細胞周期分為G1,S,G2和M四期,在各期分別存在對應的細胞周期檢測點,當細胞遭遇紫外線照射等DNA損傷時,檢測點激活,細胞周期暫時停滯,直至修復完成才進入下一周期。
　　 4.高危型HPVE7可以降解Rb蛋白,我們因此檢測58E7能否降解pRb及其家族產物p130和p107。
　　 三.IFI16抗HPV感染致富頸癌的作用及機制探討
　　 干擾素是一類具有調節(jié)細胞生長和分化、

15、抗腫瘤及抗病毒等眾多生物學功能的小分子蛋白質,干擾素誘導蛋白(interferon-inducible proteins)是干擾素抗腫瘤抗病毒等眾多生物學功能的執(zhí)行者。其中p200蛋白家族是干擾素誘導產生的眾多蛋白質的一類,而IFI16是p200家族的人源蛋白之一。
　　 1.我們首先檢測了IFI16在正常宮頸組織和宮頸癌組織中的表達,發(fā)現(xiàn)IFI16在宮頸癌中的表達顯著下調。為了進一步研究IFI16在腫瘤形成過程中的作用,我們首

16、先在宮頸癌細胞系SiHa中過表達IFI16,進行細胞增殖實驗分析。MTT分析、細胞生長曲線表明過表達IFI16明顯降低細胞的生長率,流式細胞術表明進入合成期細胞減少,β-細胞半乳糖苷酶分析顯示細胞衰老率增加。體外裸鼠腫瘤形成試驗表明在宮頸癌細胞SiHa中過表達IFI16后,細胞的致瘤性降低,裸鼠體內形成的腫瘤明顯縮小。
　　 2.另一方面我們利用RNAi(RNA interfere)技術構建能有效降低細胞內源性IFI16表達的質

17、粒pSUPER-IFI16,將其轉染HPV永生化的H8細胞建立穩(wěn)定細胞系。轉染pSUPER-IFI16的H8細胞細胞分裂增殖加快；同時進入合成期的細胞增加。將穩(wěn)定轉染pSUPER-IFI16的細胞分別皮下注射裸鼠,裸鼠體內腫瘤形成的情況表明,注射對照細胞的裸鼠體內沒有腫瘤形成;而當抑制IFI16表達,永生化細胞H8獲得了惡性轉化能力,注射穩(wěn)定轉染pSUPER-IFI16細胞的6只裸鼠體內均長出腫瘤。
　　 3.為了進一步探討IF

18、I16影響宮頸癌的機制,我們分別研究了其對癌基因HPV16E6、16E7、myb、c-myc、抑癌基因Rb、p53,以及凋亡相關基因caspase3、caspase8的表達的影響。過表達IFI16后,我們發(fā)現(xiàn)HPV16E6、16E7、myb、c-myc、caspase3、caspase8基因的mRNA表達均下調,而抑癌基因pRb和p53的mRNA表達則顯著增加。
　　 我們首次在細胞水平及動物水平系統(tǒng)地研究了IFI16對宮頸癌的