人乳頭瘤病毒16型E2蛋白誘導(dǎo)宮頸癌Caski細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制的研究.pdf

1、目的：人乳頭瘤病毒16型（HPV16）E2蛋白是HPV16病毒基因編碼的早期蛋白，是誘導(dǎo)HPV16感染的宮頸癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡的重要分子。然而，目前研究對(duì)于E2蛋白誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡有關(guān)的具體片段知之甚少。本課題將分析鑒定HPV16 E2蛋白與誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡有關(guān)片段并分析其誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，為宮頸癌的免疫治療尋找新的分子靶點(diǎn)。
　　方法：（1）將目的基因HPV16E2、HPV16NE2和HPV16HCE2構(gòu)建到真核表

2、達(dá)載體pEF1-Myc-6His-C上；（2）運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將重組質(zhì)粒pEF1-E2-Myc-6His、pEF1-NE2-Myc-6His和pEF1-HCE2-Myc-6His及空載質(zhì)粒pEF1-Myc-6His-C分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至宮頸癌細(xì)胞系Caski細(xì)胞中，并通過(guò)Western Blotting方法檢測(cè)各目的基因在Caski細(xì)胞中的表達(dá)情況；（3）用MTT法檢測(cè)分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pEF1-E2組、pEF1-NE2組和pEF1-HCE2組

3、與陰性對(duì)照組（即空載組pEF1-C）相比較Caski細(xì)胞的細(xì)胞增殖情況；（4）用Western Blotting檢測(cè)各組Caski細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-PAPR的表達(dá)情況；并用AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒與流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組Caski細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果：(1)成功構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒pEF1-E2-Myc-6His、pEF1-NE2-Myc-6His和pEF1-HCE2-Myc-6His；（

4、2）帶有Myc標(biāo)簽的HPV16E2、HPV16NE2及HPV6HCE2融合蛋白在宮頸癌細(xì)胞系Caski細(xì)胞中成功表達(dá)；(3) MTT法檢測(cè)Caski細(xì)胞的增殖情況顯示：與陰性對(duì)照組（空載組pEF1-C）相比較，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pEF1-NE2組和pEF1-HCE2組的Caski細(xì)胞的細(xì)胞增殖情況在培養(yǎng)24h、48h、72h和96h均無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p>0.05）；瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pEF1-E2組在培養(yǎng)24h細(xì)胞增殖無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p>0.05),而

5、在培養(yǎng)48h細(xì)胞增殖較陰性對(duì)照組細(xì)胞受抑制（p=0.028<0.05），72h和96h細(xì)胞增殖明顯受抑制（p<0.01）；（4）Western Blotting結(jié)果顯示pEF1-E2組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-PARP的表達(dá)量較高，而pEF1-NE2組和pEF1-HCE2組中細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-PARP則無(wú)明顯表達(dá)；AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組相比較，pEF1