霍亂弧菌O139血清群mshA基因的克隆、表達(dá)及其融合蛋白免疫性的初步研究.pdf

1、霍亂是一種烈性腸道傳染病，是我國傳染病防治法規(guī)定的甲類傳染病?；魜y弧菌被分為200多個血清群，其中只有01和0139群能引起霍亂大流行，0139霍亂弧菌(VC0139)是0139霍亂的病原體?；魜y流行菌已轉(zhuǎn)為0139型為主，浙江等地時有散發(fā)病例。國內(nèi)外不少學(xué)者發(fā)現(xiàn)菌毛與霍亂弧菌的粘附定居有關(guān)，其中甘露糖敏感血凝素(Mannose-SensitiveHemagglutinin,MSHA)屬于IV型菌毛，決定IV型菌毛的血凝活性。MSHA為

2、一免疫原，同時在霍亂弧菌在環(huán)境中存活方面起著特殊作用。主要由霍亂弧菌ElTor生物型和0139產(chǎn)生，古典生物型存在其結(jié)構(gòu)基因mshA但僅以極低水平表達(dá)并不產(chǎn)生MSHA?；魜y弧菌E1Tor生物型N16961msba基因長536bp，編碼178個氨基酸，0139：該基因序列與之一致。 本研究構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a(+)一mshA-BL21(DE3)，采用組氨酸標(biāo)簽融合表達(dá)rMSHA蛋白，經(jīng)Ni-NTA親和層析法純化，純化的rMSH

3、A蛋白免疫日本大耳兔制備抗體，采用間接ELISA法分析所制備抗體并檢測病人血清MSHA抗體。：本研究為進(jìn)一步研究MSHA的免疫學(xué)活性，以期為研制霍亂弧菌疫苗及相關(guān)診斷試劑盒奠定基礎(chǔ)。 方法 1．霍亂弧菌0139的分離鑒定及基因組DNA提取 采用常規(guī)的酚．氯仿法提取0139菌株基因組DNA，用分光光度法測定DNA的濃度和純度；根據(jù)霍亂弧菌0139編碼莢膜多糖的一特異基因rfbS，設(shè)計特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測定擴(kuò)增

4、產(chǎn)物序列從而鑒定臨床分離菌株。 2．mshA基因的擴(kuò)增 根據(jù)GenBank公布mshA基因序列，設(shè)計巢式引物并在內(nèi)引物中引入酶切位點(diǎn)(Nco，和XhoI)，高保真PCR方法擴(kuò)增目的基因。 3．T-A克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建 采用TaKaRa公司的T-A克隆試劑盒將擴(kuò)增的目的片段克隆至pMDl8-T載體中，轉(zhuǎn)化于EcoliDH5a并擴(kuò)增，堿裂解法提取質(zhì)粒。獲得滿意的測序結(jié)果后，提取質(zhì)粒pMDl8-T-rash,

5、,1，雙酶切pMDl8-T-mshA獲得目的基因和同樣雙酶切處理的pET28a(+)連接后轉(zhuǎn)化3E．coliDH5a，提取質(zhì)粒(pET28a(+)．mshA)后再次測序，并用生物學(xué)軟件與報道的mshA基因核苷酸序列進(jìn)行同源性比較。 4．重組蛋白的表達(dá)及純化 將重組原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化E．coliBL21(DE3)，經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)，在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)目的蛋白；超聲裂解細(xì)菌提取蛋白質(zhì)，通過SDS-P

6、AGE分析蛋白表達(dá)量；以His．Tag單克隆抗體為一抗WesternBlot分析重組蛋白的免疫反應(yīng)性：Ni-NTA親和層析法收集表達(dá)的帶His．Tag的目的蛋白。 5．多克隆抗體的制備及分析 用純化的目的蛋白免疫日本大耳兔制備多克隆抗體，WesternBlot檢測重組蛋白的免疫原性；ELISA測定該抗體的效價并檢測霍亂病人血清中的抗體。 結(jié)果 1．霍亂弧菌0139的分離鑒定 PCR擴(kuò)增經(jīng)測序證實(shí)獲

7、得預(yù)期大小的0139特異片段rfbS，該分離菌株為霍亂弧菌0139。 2．mshA基因的擴(kuò)增 從VC0139菌株DNA模板中高保真巢式PCR獲得預(yù)期大小的msbaflanks(842bp)和mshA(561bp)擴(kuò)增片段。 3．T-A克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建 pMDl8-T和pET28a(+)重組質(zhì)粒中的mshA基因核苷酸序列完全相同，但在pET28a(+)中融合了His．Tag。測序結(jié)果表明克隆的mshA基

8、因的序列與GenBank公布序列完全一致，融合部分與引物設(shè)計完全一致，片段共長561bp。 4．重組蛋白的表達(dá)及純化 0．5mmol／1IPTG在28℃3h以上能很好地誘導(dǎo)rMSHA的表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物主要存在于菌體超聲破碎物離心后的沉淀中；Mr約為20kDa，與預(yù)期吻合；表達(dá)蛋白量約占細(xì)菌總蛋白的25％；WesternBlot結(jié)果顯示與His．Tag單克隆抗體良好的免疫反應(yīng)性；反應(yīng)目的蛋白經(jīng)超聲處理后Ni-NTA親和層析法

9、純化，純度達(dá)95％以上。 5．多克隆抗體的制備及分析 WestemBloti證實(shí)，兔抗rMSHA抗體能與重組蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)；間接ELISA法測定該抗體效價為1：25600，同時檢測9例霍亂弧菌0139病人血清OD495吸光度值，與20例正常血清對照結(jié)果有顯著性差異。 結(jié)論 本實(shí)驗成功地從霍亂弧菌0139菌株中構(gòu)建了mshA基因的高效原核表達(dá)系統(tǒng)，所表達(dá)的融合蛋白有良好的抗原性和免疫反應(yīng)性，可作為霍亂弧