霍亂弧菌AphB蛋白氧敏感性機(jī)理的研究.pdf

1、霍亂弧茵是一種革蘭氏陰性菌，是引起霍亂的病原體，曾經(jīng)在全世界范圍內(nèi)引起過多次霍亂疾病的大流行，其致病毒力因子主要為兩種:霍亂毒素和毒素共調(diào)節(jié)菌毛。
　　LysR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子是一類在原核生物中普遍存在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白家族，該家族成員之間具有相似的分子量大小和高度保守的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包括N端結(jié)合DNA的HTH區(qū)域，以及結(jié)合輔助誘導(dǎo)物的C端結(jié)構(gòu)域，同時(shí)C端也是形成二聚體的區(qū)域。LysR家族蛋白可以調(diào)控原核生物體內(nèi)的多種生理功能，并且

2、該家族蛋白的調(diào)控活性受到環(huán)境信號(hào)的影響，這些信號(hào)作為輔助誘導(dǎo)物與該蛋白的單體結(jié)合后改變其構(gòu)象促進(jìn)二聚體的形成，進(jìn)而激活其調(diào)控功能，氧濃度感受是該蛋白家族感受的環(huán)境信號(hào)之一。以往關(guān)于氧濃度對(duì)LysR家族蛋白功能影響的研究中，僅僅是發(fā)現(xiàn)巰基被氧化修飾后會(huì)失去蛋白的調(diào)控活性，尚未發(fā)現(xiàn)其他的機(jī)制。
　　霍亂孤菌AphB蛋白屬于LysR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，是霍亂弧菌毒力調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的一個(gè)重要因子。已經(jīng)有研究表明，AphB蛋白的調(diào)控活性同樣會(huì)受到

3、氧壓的影響，AphB的C235巰基氧化修飾會(huì)抑制蛋白二聚體的形成。由于AphB還需要結(jié)合輔助誘導(dǎo)物來發(fā)揮作用，所以推測除形成二聚體受氧抑制以外，至少還有結(jié)合誘導(dǎo)物的關(guān)鍵位點(diǎn)對(duì)感受氧壓起到作用。本實(shí)驗(yàn)以AphB為研究對(duì)象，研究其除巰基氧化修飾以外的新的感受氧壓的機(jī)制。
　　本實(shí)驗(yàn)利用一種新穎的誘變菌株XL1Red對(duì)aphB進(jìn)行隨機(jī)突變，該菌株在國內(nèi)目前的蛋白質(zhì)定向進(jìn)化的研究中很少用到。將受AphB調(diào)控的下游tcpP基因的啟動(dòng)子融合l

4、ux報(bào)告基因，之后通過檢測Lux值，篩選有氧條件下tcpP基因轉(zhuǎn)錄量高于野生型的突變株。結(jié)果篩選到4株突變株，S267L、M113I、M244I和E213K，能夠在有氧條件下激活下游基因轉(zhuǎn)錄。
　　實(shí)驗(yàn)中篩選到的4株突變株的氨基酸突變位點(diǎn)都是位于AphB蛋白的C端結(jié)構(gòu)域，由于該結(jié)構(gòu)域包含形成二聚體的區(qū)域，所以本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)，分別研究了4株突變株蛋白單體之間形成二聚體的能力。結(jié)果得到E213K在有氧條件下可以形成有活性的二

5、聚體形式，可見該氨基酸位點(diǎn)突變造成了AphB的二聚體形成不受氧濃度影響，在微氧和有氧條件下均有活性。
　　由于4株突變株中除了E213K以外，其余3株對(duì)于AphB蛋白二聚體的形成沒有影響，考慮到該蛋白C端結(jié)構(gòu)域還有可能具有結(jié)合輔助誘導(dǎo)物的功能，所以實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)通過對(duì)AphB野生型和突變體的蛋白晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，進(jìn)而比較氨基酸突變對(duì)構(gòu)象的影響。結(jié)果得到了AphB蛋白野生型的晶體，同時(shí)建立了蛋白的結(jié)晶條件，有利于后續(xù)研究該蛋白質(zhì)不同變體的