上海市1962~2011年O1-O139群霍亂弧菌分子分型研究.pdf

1、霍亂是一種烈性腸道傳染病，是我國(guó)的甲類傳染病，可導(dǎo)致中毒脫水性腹瀉，死亡率高。霍亂弧菌的致病基因主要包括:1、CTX基因元件，其中ctxAB基因編碼霍亂腸毒素，作用于小腸粘膜，引起大量腸液分泌導(dǎo)致腹瀉。zot因編碼的小帶連結(jié)毒素增加小腸粘膜的滲性，對(duì)霍亂弧菌引起的腹瀉起輔助作用。ace基因編碼的輔助霍亂腸毒素可以引起腸腔積液;2、致病性島(V.choleraepathogenicityisland，VPI)，霍亂弧菌的VPI長(zhǎng)約40kb

2、，其中的tcpA基因編碼TCP菌毛，該菌毛是霍亂弧菌的腸道定居因子，也是CTXΦ的受體;3、toxR基因，是一個(gè)基本的毒力調(diào)節(jié)基因，編碼CT和TCP的基因都由toxR基因調(diào)控?；魜y弧菌的致病性是由以上幾個(gè)致病因子共同作用引起。隨著霍亂流行時(shí)間的延續(xù)，在防治霍亂過(guò)程中各種防治藥物的不斷增加、某些地區(qū)的不合理用藥以及臨床抗生素的廣泛使用使得霍亂菌株的耐藥性逐漸出現(xiàn)并增加，對(duì)各類抗生素耐藥加劇，因此霍亂弧菌多重耐藥株不斷出現(xiàn)。
　　本課

3、題旨在對(duì)1962年至2011年上海市222株O1/O139群霍亂弧菌進(jìn)行霍亂毒素基因（ctxA）和毒素協(xié)調(diào)菌毛基因（tcpA）及相關(guān)調(diào)控基因小帶聯(lián)結(jié)毒素基因（zot）、輔助霍亂腸毒素基因(ace)、溶血素基因（hlyA）、外膜蛋白基因(ompU)和調(diào)控蛋白基因（toxR）的毒力及毒力相關(guān)基因分析，研究O1/O139群霍亂弧菌流行株和非流行株的毒力基因特征差異，分析不同菌株毒力基因的分布和變化。對(duì)O1/O139群霍亂弧菌進(jìn)行噬菌體-生物分

4、型、藥物敏感試驗(yàn)，比較上海市不同年代霍亂弧菌的流行趨勢(shì)和優(yōu)勢(shì)菌型，了解霍亂弧菌的耐藥性特征和耐藥譜變化。同時(shí)對(duì)O1/O139群霍亂弧菌進(jìn)行PFGE分型和MLST分型分析，研究1962～2011年上海市的O1/O139群霍亂弧菌的分子分型特征，分析其菌群結(jié)構(gòu)。
　　采用WHO推薦的改良K-B紙片法，對(duì)1962～2011年上海市222株O1/O139群霍亂弧菌進(jìn)行11種抗菌藥物（頭孢曲松、強(qiáng)力霉素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、丁胺

5、卡那霉素、四環(huán)素、氯霉素、萘啶酸、氨芐西林、慶大霉素）敏感試驗(yàn)，分析耐藥性特征。以PCR方法檢測(cè)霍亂毒素基因（ctxA）、小帶聯(lián)結(jié)毒素基因(zot)、輔助霍亂腸毒素基因（ace）、溶血素基因（hlyA）、毒素協(xié)調(diào)菌毛基因（tcpA）、外膜蛋白基因(ompU)和調(diào)控蛋白基因（toxR）。采用脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)方法對(duì)菌株進(jìn)行分子分型，用BioNumerics軟件分析電泳圖譜。用多位點(diǎn)序列分析(MLST)方法對(duì)霍亂弧菌的七個(gè)管家基因(

6、cat、dnaE、lap、rstR、recA、gyrB、chi)進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序、比較，對(duì)霍亂弧菌的七個(gè)管家基因編號(hào)，并根據(jù)管家基因的不同組合對(duì)霍亂弧菌進(jìn)行ST分型(sequencetyping)，用BioNumerics軟件分析。
　　222株O1/O139群霍亂弧菌經(jīng)藥物敏感試驗(yàn)分析顯示，1962～1996年的菌株對(duì)多種藥物敏感，2005～2011年的菌株對(duì)多種藥物耐藥。O139群霍亂弧菌耐藥率明顯高于O1群，其多重耐藥情況嚴(yán)重

7、，O139群產(chǎn)毒株的耐藥率比非產(chǎn)毒株高。毒力基因分析顯示，1962～1996年O1群病人來(lái)源菌株中61.0％(36/59)含有7個(gè)毒力基因，2005～2011年O139群病人來(lái)源菌株中93.9％(31/33)含有7個(gè)毒力基因。1962～1996年水體來(lái)源O1群菌株12.0％(3/25)含有ctxA基因，2005～2011年水體來(lái)源O1群菌株未檢出ctxA基因。O1群霍亂弧菌水產(chǎn)來(lái)源菌株以hlyA+toxR+ompU+為主，占25.6％(

8、11/43)，O139群霍亂弧菌水產(chǎn)來(lái)源菌株以hlyA+toxR+ompU+ctxA+ace+zot+tcpA+為主，占76.1％(16/21)。PFGE分析將222株菌分為121個(gè)PFGE型，O139群霍亂弧菌分為3個(gè)聚類，O1群霍亂弧菌產(chǎn)毒株及部分非產(chǎn)毒株分為5個(gè)聚類。MLST分型將222株菌株共分為84個(gè)ST型，其中O139群霍亂弧菌分為3個(gè)ST群，O1群霍亂弧菌分為8個(gè)ST群。MLST分型顯示不同年代的霍亂弧菌產(chǎn)毒株親緣關(guān)系相近