霍亂弧菌O139的LPS0CTB結(jié)合疫苗的研究.pdf

1、霍亂是一種烈性腸道傳染病，是由革蘭氏陰性霍亂弧菌引起的嚴(yán)重水樣腹瀉疾病。人類是霍亂弧菌的天然宿主，通過食入被霍亂弧菌污染的水或食物而感染。其感染的特點(diǎn)是嚴(yán)重腹瀉和嘔吐，由于水和電解質(zhì)的流失導(dǎo)致在數(shù)小時(shí)內(nèi)造成血容量減少性休克，代謝性酸中毒和鉀的缺乏。并發(fā)癥包括腎衰竭、動(dòng)脈閉塞、肺水腫、孕婦流產(chǎn)和兒童癲癇?；魜y的流行特點(diǎn)是爆發(fā)式，歷史上曾經(jīng)爆發(fā)過7次世界大流行，開始在數(shù)個(gè)不同地點(diǎn)同時(shí)發(fā)生，然后迅速傳播流行可累及許多國(guó)家并持續(xù)多年，尤其在非洲

2、、亞洲和拉丁美洲等一些發(fā)展中國(guó)家較為嚴(yán)重。而控制它的有效途徑之一就是免疫預(yù)防接種，因此尋求研制一種安全有效適用于各種人群的霍亂疫苗極其重要。
　　 已證實(shí)霍亂弧菌細(xì)胞壁上的脂多糖(LPS)既是毒力因子又是重要的保護(hù)性抗原，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生殺弧菌抗體。但是LPS分子量較小，免疫原性弱，且再次免疫后不能產(chǎn)生免疫加強(qiáng)效應(yīng)。并且多糖類抗原不能誘導(dǎo)嬰幼兒體內(nèi)產(chǎn)生具保護(hù)水平的抗體，但此年齡組又是細(xì)菌性傳染病發(fā)病的高危人群?；魜y毒素B亞單位(C

3、TB)是霍亂毒素?zé)o毒的部分，具有良好的免疫原性，能產(chǎn)生重要的抗毒抗體。并且已經(jīng)證實(shí)CTB是一種很好的粘膜佐劑，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生粘膜免疫反應(yīng)。
　　 本研究將CTB作為載體蛋白與LPS共價(jià)結(jié)合制備成結(jié)合疫苗，給多糖成分賦予“載體效應(yīng)”，既能增強(qiáng)LPS的免疫原性，使其由T細(xì)胞非依賴抗原成為T細(xì)胞依賴抗原，又使誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)具有免疫記憶和加強(qiáng)效應(yīng)，產(chǎn)生大量的殺菌抗體；而CTB本身又能產(chǎn)生高效價(jià)的抗毒抗體，這正是抗霍亂疫苗應(yīng)該包括的兩個(gè)

4、方面。目的是制備一種安全有效的能針對(duì)各種人群的口服霍亂疫苗。
　　 本研究首先采用熱酚水法從霍亂弧菌O139中提取純化LPS，最終獲得純度良好的LPS干粉。然后用1-氰-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸(CDAP)將提取的LPS活化后與載體蛋白CTB共價(jià)偶聯(lián)，產(chǎn)物經(jīng)過Superdex200凝膠過濾層析柱進(jìn)行純化，最終制備成高純度的LPS-CTB共價(jià)結(jié)合物。用制備的LPS-CTB結(jié)合物免疫小鼠，取小鼠血清和糞便進(jìn)行ELISA檢測(cè)。采用給

5、以鹽水的小鼠做陰性對(duì)照，同時(shí)進(jìn)行單獨(dú)給LPS、單獨(dú)給CTB以及給rBS-WC疫苗的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，本研究制備的LPS-CTB結(jié)合物不僅能有效誘導(dǎo)小鼠機(jī)體產(chǎn)生血清抗LPS和抗CTB的IgG和IgA抗體，其中，抗LPS的IgG和IgA的抗體滴度分別達(dá)到1:970和1:1690，抗CTB的IgG和IgA抗體滴度更是高達(dá)1:163840。并且該結(jié)合物能很好的誘導(dǎo)小鼠的腸粘膜免疫系統(tǒng)產(chǎn)生對(duì)霍亂免疫極為重要的分泌型IgA抗體。另外在多次免疫