O139群霍亂弧菌基因工程減毒活疫苗候選株構(gòu)建及初步評(píng)價(jià).pdf

1、研究背景與目的: 霍亂是一種由霍亂弧菌引起的烈性傳染病，致劇烈腹瀉并能快速傳播。世界第七次大流行自1961年延續(xù)至今，波及世界五大洲100多個(gè)國(guó)家，尚未得到有效控制。根據(jù)O抗原，霍亂弧菌分為200多個(gè)血清群，能引起霍亂的有O1群的古典型霍亂弧菌、El Tor型霍亂弧菌及O139群霍亂弧菌?；魜y第六次大流行延續(xù)到1961年，是由古典型霍亂弧菌引起的，而第七次大流行是由El Tor型霍亂弧菌引起的。O139血清型霍亂弧菌，是自199

2、2年從印度半島開(kāi)始流行的一種新型霍亂，且O139群與O1群疫苗的交叉保護(hù)力低。有證據(jù)表明O139群霍亂弧菌起源于El Tor型霍亂弧菌，從非O1群霍亂弧菌中獲得O139表型，因此O139群霍亂弧菌獲得了O1群的毒力和非O1群霍亂弧菌的莢膜。 霍亂弧菌主要致病因子是霍亂毒素（CT），由CTX元件中的ctxAB基因編碼，受環(huán)境信號(hào)影響和調(diào)節(jié)。CTX遺傳元件來(lái)自CTXФ噬菌體，很有可能可以在環(huán)境中的霍亂弧菌間傳遞。CTXФ是一個(gè)約6．

3、9kb大小的單股絲狀噬菌體，有兩個(gè)部分組成：2．4kb的RS2序列和4．5kb的核心區(qū)。RS2是調(diào)節(jié)序列，從5’端到3’端為rstR，rstA和rstB，其中rstR編碼一抑制蛋白rstR，介導(dǎo)了CTXФ的噬菌體免疫。而核心區(qū)有六個(gè)基因，包括ctxAB操縱子。霍亂毒素由5個(gè)受體結(jié)合B亞單位圍繞1個(gè)毒性A亞單位組成，作用于小腸，與神經(jīng)節(jié)苷脂GM1結(jié)合后通過(guò)增強(qiáng)腺苷酸環(huán)化酶活性而提高腸道內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cAMP）水平，并將氯化物和碳酸氫鹽分泌

4、到小腸，導(dǎo)致水分從機(jī)體血管內(nèi)和細(xì)胞外間隙排出，迅速進(jìn)入腸腔，從而造成嚴(yán)重腹瀉。 基因敲除技術(shù)從20世紀(jì)80年代末開(kāi)始發(fā)展，在生命科學(xué)領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用前景。同源重組是基因敲除的方法之一，而自殺質(zhì)粒是一種通過(guò)同源重組技術(shù)來(lái)構(gòu)建無(wú)痕缺失突變株的有效載體，其利用目標(biāo)基因兩端的同源片段，精確定位自殺質(zhì)粒的整合位點(diǎn)。采用“上游片斷-插入基因-下游片斷”方式缺失的菌株能夠避免極性效應(yīng)，并使靶基因完全失活。 隨著對(duì)腸道黏膜免疫重要性的認(rèn)識(shí)

5、以及霍亂弧菌分子生物學(xué)研究的深入和基因重組技術(shù)的發(fā)展，霍亂疫苗的研究逐步傾向于通過(guò)基因工程方法缺失霍亂毒素及其他毒力相關(guān)基因的減毒活疫苗研制，如O1群減毒活疫苗的CVD103-HgR，Peru-15和V． cholerae638以及O139群霍亂弧菌減毒活疫苗的Bengal-15和CVD112等。這些疫苗能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生類似天然霍亂感染后的免疫反應(yīng)，但也存在一些副反應(yīng)，及可能通過(guò)噬菌體感染獲得毒力基因如CTXФ而使毒力回復(fù)。 本研

6、究以O(shè)139群霍亂弧菌ZJ199693為出發(fā)株，通過(guò)基因重組技術(shù)缺失其染色體上的主要毒力基因簇TLC、CTX和RTX，并插入rstR和ctxB基因，再進(jìn)一步缺失溶血素編碼基因hlyA，同時(shí)插入篩選標(biāo)記綠色熒光蛋白編碼基因GFPuv，構(gòu)建O139群霍亂弧菌減毒活疫苗候選株。我們的目的是缺失O139群霍亂弧菌的主要毒力基因并盡量減少疫苗候選株的副反應(yīng)及毒力回復(fù)可能，并通過(guò)綠色熒光蛋白的整合使疫苗候選株與野生菌株在環(huán)境中易于區(qū)分。 其

7、中，TLC因子功能與CTXФ獲得與復(fù)制有關(guān)，CTX基因簇主要攜帶了編碼霍亂毒素CT的ctxAB基因和CTXФ整合的attB位點(diǎn)，而RTX毒素與Hep-2細(xì)胞毒性有關(guān)，使哺乳動(dòng)物細(xì)胞肌動(dòng)蛋白交聯(lián)而致細(xì)胞圓縮?；魜y弧菌的溶血素（HlyA）是一個(gè)分子量為65000的水溶性孔形成毒素，由hlyA編碼。RTX毒素及溶血素均能引起小鼠腸道感染，都是引起霍亂弧菌減毒活疫苗反應(yīng)原性的主要因子。把TLC、CTX、RTX基因簇及hlyA基因缺失后我們能大大

8、降低霍亂弧菌毒性及毒力回復(fù)的可能性。并且，由于rstR基因編碼的產(chǎn)物能夠抑制同型噬菌體對(duì)霍亂弧菌的再轉(zhuǎn)染，插入rstR基因能進(jìn)一步降低疫苗候選株重獲毒力的可能性，提高其生物安全性，而ctxB基因編碼的霍亂毒素B亞單位能賦予機(jī)體針對(duì)疫苗的抗毒免疫能力。綠色熒光蛋白（GFP）來(lái)自維多利亞水母發(fā)光蛋白，在波長(zhǎng)為395-498nm的紫外線激發(fā)下發(fā)光。重組綠色熒光蛋白（GFPuv）基因在質(zhì)粒pGFP上，由大腸桿菌表達(dá)。GFPuv由野生GFP經(jīng)點(diǎn)突

9、變而來(lái)，氨基酸位置Ser取代Phe99，Thr取代Met153，Ala取代Val163。GFPuv在大腸桿菌中比野生GFP表達(dá)快，所發(fā)熒光比野生GFP亮，紫外線激發(fā)波長(zhǎng)為360～400nm。GFPuv，大小為27道爾頓，是由238個(gè)氨基酸組成的球狀蛋白質(zhì)，在pH5．5-11．5穩(wěn)定，最佳pH為8．0。綠色熒光蛋白整合進(jìn)疫苗候選株染色體后，菌體在360～400nm紫外激發(fā)下發(fā)綠色熒光，從而有利于在環(huán)境中檢測(cè)疫苗候選株。 研究方法:

10、 1．引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank上公布的O1群El Tor型霍亂弧菌國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株N16961及pGFPuv全序列設(shè)計(jì)引物。 2．串聯(lián)霍亂弧菌主要毒力基因簇上下游片段及氯霉素抗性基因自殺質(zhì)粒的構(gòu)建PCR擴(kuò)增霍亂弧菌主要毒力基因簇TLC-CTX-RTX的TLC上游片段（TLCu p）、RTX下游片段（RTXdown），克隆入pU18中，再在兩者間插入氯霉素抗性（cat）基因，獲得重組質(zhì)粒pUC18-TLCup-cat-RTXd

11、own。酶切回收TLCup-cat-RTXdown片段，克隆入自殺質(zhì)粒pDS132，構(gòu)建重組自殺質(zhì)粒pDS132-TLCup-cat-RTXdown。 3．霍亂弧菌主要毒力基因簇TLC-CTX-RTX缺失株9693-1的篩選通過(guò)接合將重組自殺質(zhì)粒pDS132-TLCup-cat-RTXdown轉(zhuǎn)入O139群霍亂弧菌ZJ199693，20%蔗糖選擇培養(yǎng)基（氯霉素抗性）篩選TLC、CTX、RTX基因缺失株，然后再通過(guò)PCR、測(cè)序驗(yàn)證

12、。 4．串聯(lián)霍亂弧菌主要毒力基因簇上下游片段、rstR和ctxB基因自殺質(zhì)粒的構(gòu)建PCR擴(kuò)增霍亂弧菌主要毒力基因簇TLC-CTX-RTX的TLC上游片段（TLCup）、RTX下游片段（RTXdown），克隆入pU18中，再在兩者間插入rstR和ctxB基因，獲得重組質(zhì)粒pUC18-TLCup-rstR-ctxB-RTXdown。酶切回收TLCup-rstR-ctxB-RTXdown片段，克隆入自殺質(zhì)粒pCVD442，構(gòu)建重組自殺

13、質(zhì)粒pCVD442-TLCup-rstR-ctxB-RTXdown。 5．疫苗候選株O139-45的篩選及鑒定通過(guò)接合將重組自殺質(zhì)粒pCVD442-TLCup-rstR-ctxB-RTXdown轉(zhuǎn)入TLC、CTX、RTX基因缺失株，20%蔗糖選擇培養(yǎng)基篩選cat基因被rstR和ctxB基因替換了的重組改造菌株，然后再通過(guò)PCR、測(cè)序驗(yàn)證。 6．兔腸段結(jié)扎試驗(yàn)測(cè)CT毒性ctxAB基因編碼霍亂腸毒素CT，是引起霍亂的最主要因

14、子。將霍亂弧菌注射入結(jié)扎了的兔腸段中，通過(guò)第二天觀察腸段是否有充血、積液而判定該霍亂弧菌是否產(chǎn)毒。 7．Hep-2細(xì)胞毒性試驗(yàn)測(cè)RTX毒素RTX毒素能使Hep-2細(xì)胞肌動(dòng)蛋白交聯(lián)而致細(xì)胞圓縮，因此我們通過(guò)Hep-2細(xì)胞毒性試驗(yàn)檢測(cè)度毒力基因缺失株的細(xì)胞毒性是否消失。 8．GM1-ELISA測(cè)CTB蛋白CT毒素B亞單位（CTB）能與神經(jīng)節(jié)苷脂GM1特異性結(jié)合，因此我們用GM1-ELISA檢測(cè)重獲ctxB基因的重組菌株的CT

15、B表達(dá)情況。 9．串聯(lián)溶血素上下游及綠色熒光蛋白基因的自殺質(zhì)粒的構(gòu)建PCR擴(kuò)增溶血素hlyA基因上游片段（hlyAup）、hlyA下游片段（hlyAdown），克隆入pU18中，再在兩者間插入lacz-GFPuv基因，獲得重組質(zhì)粒pUC18-hlyAup-laczGFPuv-hlyAdown。PCR擴(kuò)增hlyAup-laczGFPuv-hlyAdown片段并將其酶切克隆入自殺質(zhì)粒pCVD442，構(gòu)建重組自殺質(zhì)粒pCVD442-h

16、lyAup-laczGFPuv-hlyAdown。 結(jié)論: 1．O139群霍亂弧菌基因工程減毒活疫苗候選株的構(gòu)建構(gòu)建了出發(fā)株ZJ199693染色體上毒力相關(guān)基因簇TLC、CTX、RTX被保護(hù)性基因rstR及抗原基因ctxB替換的重組改造菌株O139-45，可作為疫苗候選株作進(jìn)一步的免疫效果考核。 2． O139群霍亂弧菌基因工程減毒活疫苗候選株的初步評(píng)價(jià)家兔小腸腸段結(jié)扎測(cè)毒試驗(yàn)顯示缺失株9693-1和疫苗候選株O

17、139-45明顯減毒，9693-1和O139-45的最主要毒力基因ctxAB被缺失。Hep-2細(xì)胞毒性試驗(yàn)顯示缺失株9693-1對(duì)Hep-2細(xì)胞毒性作用消失。GM1-ELISA顯示O139群霍亂弧菌減毒活疫苗候選株O139-45的ctxB基因表達(dá)良好。 3．串聯(lián)溶血素上下游及綠色熒光蛋白基因的自殺質(zhì)粒構(gòu)建構(gòu)建了綠色熒光蛋白表達(dá)良好的重組自殺質(zhì)粒pCVD442-hlyAup-laczGFPuv-hlyAdown，可用于進(jìn)一步對(duì)疫苗