p53在中波紫外線誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞提前衰老中的調(diào)控作用及腫瘤抑制作用的研究探討.pdf

1、中波紫外線(ultraviolet B，UVB)可誘導(dǎo)皮膚腫瘤發(fā)生，又可誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞(humm skin fibroblast，HSF)發(fā)生應(yīng)激誘導(dǎo)的提前衰老(stress-induced premature senescence，sips)。目前認(rèn)為細(xì)胞衰老是抑制腫瘤發(fā)生的機(jī)制之一，抑癌基因p53是其中關(guān)鍵的調(diào)控因子，但是在UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老中未見報道，因此，研究p53在UVB誘導(dǎo)的提前衰老中的調(diào)控作用和腫瘤抑制作用具有重要

2、的意義。本研究分四個部分探討了UVB照射誘導(dǎo)HSF發(fā)生SIPS中p53的調(diào)控作用及腫瘤抑制作用。 研究目的：第一部分探討中波紫外線(UVB)誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞(HSF)衰老與UVB輻射劑量的關(guān)系，建立UVB誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞早衰模型，為深入研究UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老與腫瘤發(fā)生的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。 第二部分探討UVB誘導(dǎo)SIPS后細(xì)胞周期調(diào)控的變化。探討p53相關(guān)得生長停滯、細(xì)胞凋亡和腫瘤發(fā)生相關(guān)基因表達(dá)在UVB誘導(dǎo)的SIPS中

3、的變化情況。初步探討UVB誘導(dǎo)SIPS在腫瘤發(fā)生機(jī)制中的作用。第三部分，轉(zhuǎn)染針對p53的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)質(zhì)粒建立抑制p53表達(dá)的HSF細(xì)胞系.探討抑制p53表達(dá)對UVB誘導(dǎo)HSF發(fā)生SIPS及其腫瘤抑制作用的影響。第四部分建立穩(wěn)定過表達(dá)野生型p53基N(wtp53)的人皮膚成纖維細(xì)胞系。探討過表達(dá)p53對UVB誘導(dǎo)SIPS及其腫瘤抑制作用的影響。 研究方法： 1.以亞毒性劑量UVB反

4、復(fù)照射HSF以誘導(dǎo)其衰老。2.衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase，SA β-gal)染色法檢測照射后細(xì)胞的SAβ-gal活性。3.四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT法)檢測HSF經(jīng)UVB輻射后的細(xì)胞增殖情況。4.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chainra

5、ction，RT-PC）檢測三種衰老相關(guān)基因即纖維結(jié)合素(fibronectin，F(xiàn)N0，骨結(jié)合素(osteonectin，ON)和平滑肌22(smooth muscle 22，SM22)基因的表達(dá)。5.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。6.蛋白印跡法(westem blot，WB)檢測細(xì)胞周期蛋白p53、p21、p16的表達(dá)。7.實時熒光定量PCR芯片的方法檢測與p53相關(guān)的生長停滯，凋亡及腫瘤發(fā)生相關(guān)的基因的mRNA表達(dá)水平。包括p53、p2

6、1、p16、p19、bax、bcl-2、缺氧誘導(dǎo)因子1a(hypoxia-induciblefactor 1 alpha subunit，HIF-la)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、人雙微球蛋白2基因(human double minute 2,hdm2)等。8.在脂質(zhì)體lipofectamineTM 2000介導(dǎo)下，分別將p53的shRNA的真核表達(dá)質(zhì)粒pGCsi

7、-p53和含有野生型p53的真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-p53導(dǎo)入HSF中，經(jīng)G418篩選抗性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆細(xì)胞系。用RT-PCR、WB和實時定量PCR分析目的基因及其蛋白表達(dá)。9.建立的抑制p53表達(dá)和p53過表達(dá)的HSF模型分別在UVB照射后進(jìn)行SA β-gal染色、MTT法、實時熒光定量PCR芯片測定。 研究結(jié)果： 第-部分：篩選出適宜的誘導(dǎo)衰老的劑量和次數(shù)，以10 mJ/cm2的亞毒性UVB劑量連續(xù)5

8、次照射HSF后，衰老的生物學(xué)特征得以明顯表現(xiàn)，包括細(xì)胞生長停滯，SA β-gal活性，衰老相關(guān)基因的表達(dá)等。在建立的衰老模型中，第一，MTT 法檢測顯示了細(xì)胞增生能力的減弱；第二，具有SA β-gal活性的陽性細(xì)胞明顯增加；第三，三種衰老相關(guān)基因，F(xiàn)N，ON和SM22的表達(dá)亦明顯增強(qiáng)。 第二部分：流式細(xì)胞儀對UVB誘導(dǎo)的SIPS模型進(jìn)行細(xì)胞周期檢測發(fā)現(xiàn)，大部分細(xì)胞發(fā)生了G1期阻滯；衰老通路中p53，p21和p16的表達(dá)都明顯增加

9、；實時熒光定量PCR芯片檢測發(fā)現(xiàn)，與生長停滯相關(guān)的抑癌基因p53、p21、p16、p19的表達(dá)均上調(diào)；p53下游的凋亡相關(guān)基因中的抑凋亡基因bcl.2表達(dá)稍上調(diào)，而凋亡基因bax表達(dá)下調(diào)；在腫瘤發(fā)生相關(guān)基因中，癌基因HIF-la、VEGF、hdm2的表達(dá)均下調(diào)。 第三部分：成功建立RNA干擾抑制p53表達(dá)的HSF細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染細(xì)胞中p53基因及蛋白水平明顯下調(diào)。抑制p53表達(dá)的細(xì)胞株經(jīng)UVB照射后SA β-gal活性降低，具有抑制

10、UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞生長停滯的作用。腫瘤發(fā)生相關(guān)基因檢測結(jié)果表明抑制p53表達(dá)可抑制衰老基因的表達(dá)，但p16通路并不受之影響，在UVB作用下仍可發(fā)揮作用。抑制p53的表達(dá)可使抑凋亡基因bcl-2上調(diào)及促凋亡基因bax下調(diào)，癌基因HIF-la、VEGF、hdm2表達(dá)明顯增加。這些p53依賴的細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤作用被抑制。UVB照射與否對這兩種作用無明顯影響。 第四部分：成功建立過表達(dá)p53的HSF細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染細(xì)胞中存在p53基因及蛋白

11、的穩(wěn)定過表達(dá)。過表達(dá)p53的細(xì)胞株經(jīng)UVB照射后SA β-gal活性未見增高，對UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞生長停滯的影響并不顯著。腫瘤發(fā)生相關(guān)基因檢測結(jié)果表明過表達(dá)p53未能提高衰老基因的表達(dá)；過表達(dá)p53可使抑凋亡基因bcl-2下調(diào)及促凋亡基因bax上調(diào)；癌基因HIF-la、VEGF、hdm2表達(dá)明顯降低。這些p53依賴的細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤作用因p53的過表達(dá)而更為顯著。UVB照射可加強(qiáng)這兩種作用。 結(jié)論： 第一部分：反復(fù)亞毒性

12、劑量UVB照射HSF可誘導(dǎo)其SIPS發(fā)生，表現(xiàn)出與復(fù)制衰老(RS)的成纖維細(xì)胞許多共同的特征。實驗成功建立了一種UVB誘導(dǎo)的HSF的SIPS模型，可用于進(jìn)一步的相關(guān)研究。 第二部分：G1期阻滯和衰老信號通路蛋白表達(dá)增加進(jìn)一步印證了UVB誘導(dǎo)HSF發(fā)生的SIPS。p53信號通路相關(guān)基因的表達(dá)變化提示UVB誘導(dǎo)的SIPS可能具有與p53相關(guān)的抗凋亡和腫瘤抑制的作用，但其中p53信號通路所起的作用還需更進(jìn)一步的實驗探索。 第三

13、部分：抑制p53表達(dá)能夠延遲或部分抑制HSF的復(fù)制衰老和UVB誘導(dǎo)的SIPS。UVB誘導(dǎo)的SIPS中的部分腫瘤抑制機(jī)制確由p53所調(diào)控，抑制p53表達(dá)可使部分p53依賴的細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤作用明顯缺失，從而有助于腫瘤的發(fā)生。 第四部分：過表達(dá)p53不能促進(jìn)HSF的復(fù)制衰老和UVB誘導(dǎo)的SIPS。過表達(dá)p53可使p53依賴的細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤作用明顯增強(qiáng)，UVB還可加強(qiáng)這種作用，從而有助于抑制腫瘤發(fā)生。在UVB作用下，過表達(dá)p53