納米材料活細(xì)胞標(biāo)記示蹤及其生物毒性效應(yīng)評估.pdf

1、納米科學(xué)與生物科學(xué)、醫(yī)學(xué)以及環(huán)境科學(xué)的相互交叉、深度融合催生了納米生物醫(yī)學(xué)和納米生物安全研究。本文對納米材料在活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)標(biāo)記成像和示蹤中的應(yīng)用進(jìn)行了研究，同時(shí)用斑馬魚對其生物毒性效應(yīng)進(jìn)行了系統(tǒng)評估。主要研究內(nèi)容如下：
　　 1.構(gòu)建了基于核酸適配子的納米生物探針并將其成功用于朊蛋白細(xì)胞內(nèi)在化途徑研究。將巰基修飾的核酸適配子偶聯(lián)到金納米粒子表面，制備得到細(xì)胞型朊蛋白特異性核酸適配子修飾的金納米粒子光學(xué)探針，并將其成功應(yīng)用到細(xì)胞

2、表面朊蛋白的光散射成像和電子透射顯微成像分析。通過對核酸適配子修飾的金納米粒子探針進(jìn)入細(xì)胞的途徑及其在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)命運(yùn)的進(jìn)一步研究表明，窖蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用可能是其進(jìn)入細(xì)胞的一個(gè)重要途徑。核酸適配子修飾的金納米粒子探針制備簡單、成本低廉，可能被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域。
　　 2.發(fā)展了一種基于核酸適配子修飾銀納米粒子的新型光學(xué)探針。本文將銀納米粒子作為發(fā)光元件，核酸適配子作為分子識(shí)別元件，構(gòu)建了細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的標(biāo)記成像探針并應(yīng)用

3、于單顆納米粒子光譜分析。銀納米粒子用鏈霉親和素包被并用核酸適配子功能化后，在細(xì)胞培養(yǎng)中顯示出良好的生物相容性和穩(wěn)定性，可同時(shí)作為暗場光散射成像和透射電子顯微成像的光學(xué)探針；不僅如此，銀納米顆粒的超靈敏單粒子散射光譜還可能被潛在的用于細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境分析。進(jìn)一步研究表明，窖蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用可能是銀納米探針標(biāo)記的朊蛋白進(jìn)入神經(jīng)瘤母細(xì)胞的一個(gè)必要途徑。核酸適配子修飾的銀納米探針可作為暗場光散射成像和透射電子顯微成像的雙料成像代理，且具有超靈敏的

4、單粒子光譜，這些優(yōu)良的性質(zhì)使其在未來的生物醫(yī)學(xué)成像和疾病探測上具有極大的應(yīng)用潛質(zhì)。
　　 3.提出了一種通用而簡單的基于多功能核酸適配子介導(dǎo)的活細(xì)胞表面蛋白質(zhì)納米標(biāo)記新策略。通過設(shè)計(jì)使核酸適配子成為綜合了靶標(biāo)識(shí)別功能和配體連接功能為一體的雙功能代理，成功地實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞表面靶蛋白的特異性標(biāo)記和示蹤。該策略運(yùn)用分步標(biāo)記的方法，先用生物素化的核酸適配子去捕獲細(xì)胞表面的靶蛋白，然后再用鏈霉親和素修飾的納米探針識(shí)別靶蛋白上的生物素，從而實(shí)

5、現(xiàn)對活細(xì)胞表面靶蛋白的特異性標(biāo)記。我們應(yīng)用該標(biāo)記方法不但實(shí)現(xiàn)了多種納米探針對核仁蛋白的標(biāo)記及多模式成像，而且還用量子點(diǎn)對朊蛋白在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和動(dòng)力學(xué)過程實(shí)施了成功的監(jiān)測。該標(biāo)記策略操作簡單，避免了傳統(tǒng)納米探針復(fù)雜的修飾和分離步驟。更為重要的是，我們提出的這一標(biāo)記策略是一種可通用的蛋白質(zhì)標(biāo)記方法。
　　 4.采用水環(huán)境暴露和顯微注射相結(jié)合的方法，系統(tǒng)考察了納米熒光量子點(diǎn)在斑馬魚體內(nèi)外的分布情況和毒性效應(yīng)。研究結(jié)果表明，多聚乙二醇修飾

6、的量子點(diǎn)在胚胎卵膜和仔魚體表的吸附能力弱，表面的電荷對其在卵膜上的吸附能力無明顯影響；水環(huán)境中的羧基化量子點(diǎn)可在斑馬魚卵膜上大量吸附，也會(huì)在仔魚的口咽腔、鰓、鰭條、排泄孔等部位聚集，并可通過仔魚的吞咽作用進(jìn)入消化道。高濃度的羧基化量子點(diǎn)在水環(huán)境中暴露會(huì)誘導(dǎo)胚胎的畸形發(fā)育，這些毒性效應(yīng)可能是由金屬鎘的釋放所致。心臟顯微注射的羧基化量子點(diǎn)會(huì)隨血液循環(huán)進(jìn)入到斑馬魚的靜脈系統(tǒng)，但很少會(huì)在內(nèi)臟中殘留，其主要分布于后大腦靜脈、眶鼻靜脈、心臟壁、腹腔

7、壁、后主靜脈、體節(jié)動(dòng)脈及尾部動(dòng)脈和靜脈。羧基化量子點(diǎn)在注射后6天仍大量殘存于靜脈血管內(nèi)，不被機(jī)體排除，顯示出較高的生物吸附能力和體內(nèi)殘存量，具有較高的生物毒性風(fēng)險(xiǎn)。
　　 5.以斑馬魚為模式生物，對石墨烯和多壁碳納米管的生物毒性效應(yīng)進(jìn)行了比較研究。石墨烯是一種新型的碳納米材料，優(yōu)良的物理化學(xué)性質(zhì)使其在未來的光熱傳感、電子傳導(dǎo)等領(lǐng)域極具發(fā)展?jié)摿?，但到目前為止卻未見其生物毒性研究報(bào)道。研究結(jié)果表明，石墨烯的生物毒性較弱，在濃度為50

8、mg/L才會(huì)引起明顯的細(xì)胞生長抑制和輕微的斑馬魚胚胎孵化延遲效應(yīng)，但不會(huì)導(dǎo)致胚胎內(nèi)細(xì)胞凋亡的增加和嚴(yán)重的胚胎發(fā)育畸形。與之相比，多壁碳納米管具有較強(qiáng)的生物毒性，在濃度為7.6mg/L就能明顯抑制細(xì)胞生長；在濃度為50mg/L時(shí)，多壁碳納米管會(huì)在斑馬魚胚胎卵膜表面大量吸附，導(dǎo)致胚胎內(nèi)細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增加，最終引起胚胎發(fā)育畸形。該研究結(jié)果提示，石墨烯和碳納米管在一定條件下都表現(xiàn)出生物毒性效應(yīng)。同時(shí)，石墨烯和多壁碳納米管雖然具有相似的納米形態(tài)