BrdU標記示蹤脂肪成體干細胞成骨分化的實驗研究.pdf

1、因創(chuàng)傷、腫瘤切除、感染等原因引起的骨缺損和骨不連是骨科臨床上常見的問題，也是治療上比較棘手的問題。近些年來，隨著組織工程技術的迅速興起與發(fā)展，試圖通過骨組織工程來解決上述問題已逐漸成為研究的熱點。骨組織工程技術主要包括種子細胞、支架材料、細胞因子等要素。其中種子細胞的來源是骨組織工程中首先需要解決的問題，并且是保證骨組織工程能夠進一步深入發(fā)展的前提。獲取一種功能良好、來源充足的理想種子細胞已成為目前骨組織工程研究和發(fā)展的迫切任務之一。在

2、本課題中，我們選擇了一種新型來源的種子干細胞—脂肪成體干細胞。通過用BrdU標記脂肪成體干細胞，體外成骨誘導，然后植入體內，示蹤其在體內的分化行為，從而探討脂肪成體干細胞作為種子細胞在骨組織工程中廣泛應用的可行性。
　　目的：
　　從兔脂肪組織中分離出脂肪成體干細胞（ADASCs），體外進行原代及傳代培養(yǎng)后，用BrdU進行標記，觀察BrdU對ADASCs生長增殖狀況的影響，探索BrdU用于標記脂肪成體干細胞的可行性。如果可行

3、，那用BrdU標記ADASCs，體外成骨方向誘導后，植入體內，示蹤ADASCs在體內的分化行為，從而探討ADASCs作為種子細胞在骨組織工程中廣泛應用的可行性。
　　方法：
　　1.BrdU體外標記ADASCs
　　從成年新西蘭大白兔頸背部成功獲取脂肪組織，剝離剪碎后用Ⅰ型膠原酶消化，得到ADASCs。分離培養(yǎng)ADASCs,第三代ADASCs融合約50％時,加入終濃度25μmol/L的BrdU孵育48h,BrdU免疫組

4、化染色，檢測標記情況。然后通過顯微鏡下形態(tài)學觀察、臺盼藍排斥試驗、MTT試驗，觀測BrdU對ADASCs生長增殖狀況的影響。
　　2.BrdU標記示蹤脂肪成體干細胞體內成骨分化
　　在確定BrdU可以用于標記ADASCs的基礎上，將BrdU標記過的ADASCs體外向成骨方向誘導分化培養(yǎng)，通過堿性磷酸酶Gomori改良鈣鈷法染色、茜素紅鈣結節(jié)染色、Ⅰ型膠原免疫組化染色鑒定ADASCs成骨分化情況。然后將BrdU標記后誘導分化培

5、養(yǎng)2周的ADASCs與兔松質骨載體(rabbitcancellousbone,RCB)復合,并通過掃描電鏡觀察ADASCs在RCB上的生長情況，在成骨誘導培養(yǎng)基中共培養(yǎng)7天后，植入ADASCs所屬的自體兔肌袋內。分別于4周、8周、12周后取材,切片HE染色觀察新骨生成情況；切片BrdU免疫組化染色觀察ADASCs在體內的分化及成骨情況，探討ADASCs作為種子細胞在骨組織工程中廣泛應用是否可行。
　　結果：
　　1.BrdU

6、加入ADASCs中孵育48h后，通過細胞爬片BrdU免疫組化染色結果顯示：BrdU可以成功標記ADASCs，標記率為(82.3±8.6)％。顯微鏡下觀察BrdU標記后的ADASCs與未標記的ADASCs生長形態(tài)基本一致。臺盼藍排斥試驗結果顯示：BrdU標記后的ADASCs，活細胞率為(94.4±1.5)％；未標記的ADASCs，活細胞率為(95.2±1.2)％；兩者并無顯著性差異（P>0.05），說明BrdU對細胞的活性基本沒有影響。M

7、TT試驗結果顯示：BrdU標記后的ADASCs與未標記ADASCs在各時間點均無顯著性差異（P>0.05）,兩者的生長增殖趨勢基本一致。
　　2.BrdU標記后的ADASCs向成骨方向誘導培養(yǎng)后，堿性磷酸酶Gomori改良鈣鈷法染色、茜素紅鈣結節(jié)染色、Ⅰ型膠原免疫組化染色結果均呈陽性，說明向成骨方向誘導成功。ADASCs與RCB復合后，掃描電鏡觀察ADASCs呈良好相容性生長。取材HE染色結果顯示：4周無明顯成骨，8周及12周有較

8、明確的新骨生成；切片BrdU免疫組化染色結果顯示：新骨生成處有染色陽性細胞，說明先前標記的ADASCs植入體內后可以形成新骨。
　　結論：
　　BrdU用于標記ADASCs是完全可行的，并且是比較理想的手段和方法，因此，BrdU完全可以用于標記示蹤ADASCs植入體內后的分化行為。
　　ADASCs體外成骨誘導后，植入體內能夠繼續(xù)維持向成骨方向分化，進一步形成新骨。這樣就肯定和明確了ADASCs在體內的成骨能力,從而為