BrdU標(biāo)記示蹤脂肪成體干細(xì)胞成骨分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、因創(chuàng)傷、腫瘤切除、感染等原因引起的骨缺損和骨不連是骨科臨床上常見的問題，也是治療上比較棘手的問題。近些年來，隨著組織工程技術(shù)的迅速興起與發(fā)展，試圖通過骨組織工程來解決上述問題已逐漸成為研究的熱點(diǎn)。骨組織工程技術(shù)主要包括種子細(xì)胞、支架材料、細(xì)胞因子等要素。其中種子細(xì)胞的來源是骨組織工程中首先需要解決的問題，并且是保證骨組織工程能夠進(jìn)一步深入發(fā)展的前提。獲取一種功能良好、來源充足的理想種子細(xì)胞已成為目前骨組織工程研究和發(fā)展的迫切任務(wù)之一。在

2、本課題中，我們選擇了一種新型來源的種子干細(xì)胞—脂肪成體干細(xì)胞。通過用BrdU標(biāo)記脂肪成體干細(xì)胞，體外成骨誘導(dǎo)，然后植入體內(nèi)，示蹤其在體內(nèi)的分化行為，從而探討脂肪成體干細(xì)胞作為種子細(xì)胞在骨組織工程中廣泛應(yīng)用的可行性。
　　目的：
　　從兔脂肪組織中分離出脂肪成體干細(xì)胞（ADASCs），體外進(jìn)行原代及傳代培養(yǎng)后，用BrdU進(jìn)行標(biāo)記，觀察BrdU對ADASCs生長增殖狀況的影響，探索BrdU用于標(biāo)記脂肪成體干細(xì)胞的可行性。如果可行

3、，那用BrdU標(biāo)記ADASCs，體外成骨方向誘導(dǎo)后，植入體內(nèi)，示蹤ADASCs在體內(nèi)的分化行為，從而探討ADASCs作為種子細(xì)胞在骨組織工程中廣泛應(yīng)用的可行性。
　　方法：
　　1.BrdU體外標(biāo)記ADASCs
　　從成年新西蘭大白兔頸背部成功獲取脂肪組織，剝離剪碎后用Ⅰ型膠原酶消化，得到ADASCs。分離培養(yǎng)ADASCs,第三代ADASCs融合約50％時(shí),加入終濃度25μmol/L的BrdU孵育48h,BrdU免疫組

4、化染色，檢測標(biāo)記情況。然后通過顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察、臺盼藍(lán)排斥試驗(yàn)、MTT試驗(yàn)，觀測BrdU對ADASCs生長增殖狀況的影響。
　　2.BrdU標(biāo)記示蹤脂肪成體干細(xì)胞體內(nèi)成骨分化
　　在確定BrdU可以用于標(biāo)記ADASCs的基礎(chǔ)上，將BrdU標(biāo)記過的ADASCs體外向成骨方向誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，通過堿性磷酸酶Gomori改良鈣鈷法染色、茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色、Ⅰ型膠原免疫組化染色鑒定ADASCs成骨分化情況。然后將BrdU標(biāo)記后誘導(dǎo)分化培

5、養(yǎng)2周的ADASCs與兔松質(zhì)骨載體(rabbitcancellousbone,RCB)復(fù)合,并通過掃描電鏡觀察ADASCs在RCB上的生長情況，在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中共培養(yǎng)7天后，植入ADASCs所屬的自體兔肌袋內(nèi)。分別于4周、8周、12周后取材,切片HE染色觀察新骨生成情況；切片BrdU免疫組化染色觀察ADASCs在體內(nèi)的分化及成骨情況，探討ADASCs作為種子細(xì)胞在骨組織工程中廣泛應(yīng)用是否可行。
　　結(jié)果：
　　1.BrdU

6、加入ADASCs中孵育48h后，通過細(xì)胞爬片BrdU免疫組化染色結(jié)果顯示：BrdU可以成功標(biāo)記ADASCs，標(biāo)記率為(82.3±8.6)％。顯微鏡下觀察BrdU標(biāo)記后的ADASCs與未標(biāo)記的ADASCs生長形態(tài)基本一致。臺盼藍(lán)排斥試驗(yàn)結(jié)果顯示：BrdU標(biāo)記后的ADASCs，活細(xì)胞率為(94.4±1.5)％；未標(biāo)記的ADASCs，活細(xì)胞率為(95.2±1.2)％；兩者并無顯著性差異（P>0.05），說明BrdU對細(xì)胞的活性基本沒有影響。M

7、TT試驗(yàn)結(jié)果顯示：BrdU標(biāo)記后的ADASCs與未標(biāo)記ADASCs在各時(shí)間點(diǎn)均無顯著性差異（P>0.05）,兩者的生長增殖趨勢基本一致。
　　2.BrdU標(biāo)記后的ADASCs向成骨方向誘導(dǎo)培養(yǎng)后，堿性磷酸酶Gomori改良鈣鈷法染色、茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色、Ⅰ型膠原免疫組化染色結(jié)果均呈陽性，說明向成骨方向誘導(dǎo)成功。ADASCs與RCB復(fù)合后，掃描電鏡觀察ADASCs呈良好相容性生長。取材HE染色結(jié)果顯示：4周無明顯成骨，8周及12周有較

8、明確的新骨生成；切片BrdU免疫組化染色結(jié)果顯示：新骨生成處有染色陽性細(xì)胞，說明先前標(biāo)記的ADASCs植入體內(nèi)后可以形成新骨。
　　結(jié)論：
　　BrdU用于標(biāo)記ADASCs是完全可行的，并且是比較理想的手段和方法，因此，BrdU完全可以用于標(biāo)記示蹤ADASCs植入體內(nèi)后的分化行為。
　　ADASCs體外成骨誘導(dǎo)后，植入體內(nèi)能夠繼續(xù)維持向成骨方向分化，進(jìn)一步形成新骨。這樣就肯定和明確了ADASCs在體內(nèi)的成骨能力,從而為