玉米絲氨酸消旋酶作為新型篩選標記轉化南抗楊的研究.pdf

1、楊樹作為林業(yè)生產中的模式植物，具有生長速度快、適應性強及產量大等優(yōu)點，在保護環(huán)境和維持生態(tài)平衡以及作為工業(yè)原料方面發(fā)揮重要作用。南抗楊是速生和豐產性能優(yōu)良的新品種。傳統(tǒng)的選擇標記基因可能會發(fā)生基因漂流，會對生態(tài)環(huán)境以及人類健康產生不良的影響。因此選擇一個有效并且安全的篩選標記基因極為必要的。絲氨酸消旋酶（SR）作為一種雙功能酶，同時具有消旋酶和脫水酶活性，不僅能將L-/D-絲氨酸轉化成相應的D-/L-絲氨酸；而且可以將L-/D-絲氨酸轉

2、化成丙酮酸。絲氨酸消旋酶作為一種無抗性選擇標記基因，對于植物中的D-絲氨酸具有解毒的功能，并且對于生態(tài)環(huán)境不會造成污染，是一種安全的篩選標記基因。因此研究該標記基因能否能在木本植物中高效表達，具有重要的科學意義和應用前景。
　　本研究以南抗楊的葉片為受體材料，將含有ZmSR基因的質粒導入到根癌農桿菌LBA4404中，利用農桿菌介導法將ZmSR基因導入到南抗楊中，并對南抗楊的葉片和分化芽進行D-絲氨酸的抗性篩選，最終對已轉化的抗性植

3、株進行分子檢測。實驗獲得了以下結果：
　　(1)對重組載體進行Bstp I、Nco I雙酶切驗證，證明ZmSR基因正確連入表達載體；將質粒pBI1301-ZmSR進行測序，測序結果與玉米的絲氨酸消旋酶預測基因（NM_001143028.1）序列比對結果完全一致，證明質粒pBI1301-ZmSR的正確性；制備根癌農桿菌LBA4404感受態(tài)細胞，并通過液氮凍融法將質粒pBI1301-ZmSR導入到LBA4404感受態(tài)細胞中。從農桿菌中

4、提取質粒進行Bstp I、Nco I雙酶切驗證，結果得到ZmSR和pBI1301載體兩個大小的片段。根據玉米絲氨酸消旋酶基因序列設計引物，對提取的農桿菌pBI1301-ZmSR質粒PCR驗證，證明了重組質粒已成功導入農桿菌中，可以用來進行遺傳轉化。
　　(2)進行了南抗楊葉片分化和不定芽生根的D-絲氨酸的敏感性試驗，確定葉片分化的臨界濃度為15mM，生根的臨界濃度為12.5mM。
　　(3)以南抗楊組培苗的葉片為材料，通過農

5、桿菌介導法將pBI1301-ZmSR導入到葉片以及愈傷組織進行遺傳轉化，并以pBI121-GUS轉化南抗楊的葉片以及愈傷組織作為對照，對比試驗發(fā)現(xiàn)轉GUS基因的南抗楊葉片以及愈傷組織比轉ZmSR基因分化率高，但轉ZmSR基因的污染率較轉GUS基因的污染率低。
　　(4)篩選轉化植株，最后共獲得12株D-絲氨酸抗性苗，經分子檢測共有3株植株為陽性植株。
　　(5)煉苗移栽并對轉基因植株的表型性狀進行觀察，非轉基因植株作為對照，