邊緣無(wú)漿體病分子診斷ELISA和溫氏附紅細(xì)胞體PCR檢測(cè)方法的建立.pdf

1、邊緣無(wú)漿體病和附紅細(xì)胞體病是影響?zhàn)B牛業(yè)的兩種主要的寄生蟲(chóng)疾病。兩種病的臨床表現(xiàn)均表現(xiàn)為貧血、黃疸、食欲不振、消瘦等。邊緣無(wú)漿體和附紅細(xì)胞體都是寄生于血液中的寄生蟲(chóng)，染色鏡檢很難區(qū)分，因此本實(shí)驗(yàn)室分別建立邊緣無(wú)漿體和附紅細(xì)胞體的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法用于它們的臨床調(diào)查。 無(wú)漿體病(Anaplasmosis)是由邊緣無(wú)漿體(A.marginle)經(jīng)蜱傳播而引起的一種傳染性血液寄生蟲(chóng)病。本病廣泛存在于世界各種地理?xiàng)l件之下，本病主要引起牛、羊、

2、鹿等家畜發(fā)病，嚴(yán)重的可以致死，牛死亡率可達(dá)80％。它是阻礙養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展的幾種主要蜱傳播疾病中分布最廣的一種。本文選取邊緣無(wú)漿體部分基因構(gòu)建載體并進(jìn)行表達(dá)，以此表達(dá)蛋白為抗原建立邊緣無(wú)漿體間接ELISA檢測(cè)方法，用于調(diào)查邊緣無(wú)漿體的流行病學(xué)。并為邊緣無(wú)漿體檢測(cè)試劑盒的建立奠定基礎(chǔ)。 根據(jù)GenBank公布的邊緣無(wú)漿體MSP5基因序列(AY714547)設(shè)計(jì)一對(duì)引物，用PCR方法從無(wú)菌頸靜脈采集姬姆薩染色鏡檢邊緣無(wú)漿體為陽(yáng)性的牛血的D

3、NA模板中擴(kuò)增MSP5基因582bp的片斷。將該片段克隆到原核表達(dá)載體pGEX-KG中，構(gòu)建原核表達(dá)載體KG-MSP5，轉(zhuǎn)化BL21，在IPTG的誘導(dǎo)下表達(dá)大小約46kD的蛋白。利用BugBuster GST Bind，Purification Kit將其純化，經(jīng)Western blot分析表明，該蛋白具有良好的免疫反應(yīng)活性。 將可溶性表達(dá)產(chǎn)物變性和復(fù)性后包被酶標(biāo)板建立了間接ELISA方法，特異性試驗(yàn)表明其只能特異性地與邊緣無(wú)漿

4、體反應(yīng)。與試劑盒(cELISA方法.VMRD，Inc.)同時(shí)檢測(cè)478份臨床樣品，符合率為98.54％。利用該方法對(duì)湖北省、江蘇省、新西蘭、澳大利亞、加拿大466份臨床樣品進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果表明湖北省樣品中邊緣無(wú)漿體陽(yáng)性率分別為12.89％，而江蘇省、新西蘭、澳大利亞、加拿大樣品中未檢測(cè)到邊緣無(wú)漿體。 附紅細(xì)胞體病是由附紅細(xì)胞體(Eperythrozoon)寄生于多種動(dòng)物的紅細(xì)胞表面、血漿及骨髓中引起的一種人畜共患病。關(guān)于附紅細(xì)胞體

5、的分類(lèi)地位目前仍有爭(zhēng)議，傳統(tǒng)的分類(lèi)學(xué)方法將附紅細(xì)胞體列為立克次氏體，但是近年來(lái)16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果表明，附紅細(xì)胞體更接近于支原體(Mycoplasma)。近幾年，國(guó)內(nèi)對(duì)該病的報(bào)道日益增多，它給畜牧業(yè)造成巨大的損失。 到目前為止，溫氏附紅細(xì)胞體還沒(méi)有能夠純培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法也一般以顯微鏡鏡檢為主，在紅細(xì)胞表面或血漿中能看到溫氏附紅細(xì)胞體的存在。但是顯微鏡鏡檢的敏感性和特異性較差，而且及易造成假陽(yáng)性。血清學(xué)方法

6、也存在著沒(méi)有較好的抗原制備方法以及不能區(qū)分是否是正在感染蟲(chóng)等局限性。近來(lái)，DNA雜交、PCR等實(shí)驗(yàn)方法提高了檢測(cè)方法的靈敏度。 為建立特異、敏感、快速的溫氏附紅細(xì)胞體診斷方法，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已測(cè)得的溫氏附紅細(xì)胞體16S rRNA基因序列(Genbank登陸號(hào)為AY946266)，設(shè)計(jì)一對(duì)種特異性引物，建立了溫氏附紅細(xì)胞體的PCR診斷方法。特異性試驗(yàn)和敏感性試驗(yàn)表明，此診斷方法只能特異性地?cái)U(kuò)增溫氏附紅細(xì)胞體的16S rRNA基因序列