邊緣無漿體病分子診斷ELISA和溫氏附紅細胞體PCR檢測方法的建立.pdf

1、邊緣無漿體病和附紅細胞體病是影響?zhàn)B牛業(yè)的兩種主要的寄生蟲疾病。兩種病的臨床表現(xiàn)均表現(xiàn)為貧血、黃疸、食欲不振、消瘦等。邊緣無漿體和附紅細胞體都是寄生于血液中的寄生蟲，染色鏡檢很難區(qū)分，因此本實驗室分別建立邊緣無漿體和附紅細胞體的實驗室檢測方法用于它們的臨床調(diào)查。 無漿體病(Anaplasmosis)是由邊緣無漿體(A.marginle)經(jīng)蜱傳播而引起的一種傳染性血液寄生蟲病。本病廣泛存在于世界各種地理條件之下，本病主要引起牛、羊、

2、鹿等家畜發(fā)病，嚴重的可以致死，牛死亡率可達80％。它是阻礙養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展的幾種主要蜱傳播疾病中分布最廣的一種。本文選取邊緣無漿體部分基因構建載體并進行表達，以此表達蛋白為抗原建立邊緣無漿體間接ELISA檢測方法，用于調(diào)查邊緣無漿體的流行病學。并為邊緣無漿體檢測試劑盒的建立奠定基礎。 根據(jù)GenBank公布的邊緣無漿體MSP5基因序列(AY714547)設計一對引物，用PCR方法從無菌頸靜脈采集姬姆薩染色鏡檢邊緣無漿體為陽性的牛血的D

3、NA模板中擴增MSP5基因582bp的片斷。將該片段克隆到原核表達載體pGEX-KG中，構建原核表達載體KG-MSP5，轉化BL21，在IPTG的誘導下表達大小約46kD的蛋白。利用BugBuster GST Bind，Purification Kit將其純化，經(jīng)Western blot分析表明，該蛋白具有良好的免疫反應活性。 將可溶性表達產(chǎn)物變性和復性后包被酶標板建立了間接ELISA方法，特異性試驗表明其只能特異性地與邊緣無漿

4、體反應。與試劑盒(cELISA方法.VMRD，Inc.)同時檢測478份臨床樣品，符合率為98.54％。利用該方法對湖北省、江蘇省、新西蘭、澳大利亞、加拿大466份臨床樣品進行調(diào)查，結果表明湖北省樣品中邊緣無漿體陽性率分別為12.89％，而江蘇省、新西蘭、澳大利亞、加拿大樣品中未檢測到邊緣無漿體。 附紅細胞體病是由附紅細胞體(Eperythrozoon)寄生于多種動物的紅細胞表面、血漿及骨髓中引起的一種人畜共患病。關于附紅細胞體

5、的分類地位目前仍有爭議，傳統(tǒng)的分類學方法將附紅細胞體列為立克次氏體，但是近年來16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析的結果表明，附紅細胞體更接近于支原體(Mycoplasma)。近幾年，國內(nèi)對該病的報道日益增多，它給畜牧業(yè)造成巨大的損失。 到目前為止，溫氏附紅細胞體還沒有能夠純培養(yǎng)。實驗室檢測方法也一般以顯微鏡鏡檢為主，在紅細胞表面或血漿中能看到溫氏附紅細胞體的存在。但是顯微鏡鏡檢的敏感性和特異性較差，而且及易造成假陽性。血清學方法

6、也存在著沒有較好的抗原制備方法以及不能區(qū)分是否是正在感染蟲等局限性。近來，DNA雜交、PCR等實驗方法提高了檢測方法的靈敏度。 為建立特異、敏感、快速的溫氏附紅細胞體診斷方法，根據(jù)本實驗室已測得的溫氏附紅細胞體16S rRNA基因序列(Genbank登陸號為AY946266)，設計一對種特異性引物，建立了溫氏附紅細胞體的PCR診斷方法。特異性試驗和敏感性試驗表明，此診斷方法只能特異性地擴增溫氏附紅細胞體的16S rRNA基因序列