羊無漿體間接ELISA檢測方法的建立與應(yīng)用.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、羊無漿體(Anaplasma ovis)是一種由媒介蜱傳播的專性紅細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性菌,主要引起綿羊和山羊的無漿體病。羊無漿體病臨床癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)熱、貧血、黃疸和消瘦,嚴(yán)重時可導(dǎo)致死亡。羊無漿體病在全世界呈廣泛流行,阻礙了養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展,給養(yǎng)羊業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前,針對該病的檢測技術(shù)主要有血涂片顯微鏡鏡檢和PCR,但是相對于基層單位,顯微鏡鏡檢專業(yè)性太強,PCR儀器較為昂貴,且由于基層的科研條件有限,所以在實際生產(chǎn)中推廣應(yīng)用

2、較困難。本研究以羊無漿體為研究對象,通過質(zhì)譜和生物信息學(xué)分析技術(shù),鑒定出羊無漿體特異性的Anaplasma ovis Appendage-Associated Protein(AAAP),針對該蛋白,建立了檢測羊無漿體特異性抗體的間接ELISA檢測技術(shù)。應(yīng)用本研究建立的方法,對采自我國23個省份54個不同地區(qū)的3138份血清進(jìn)行羊無漿體病的血清學(xué)流行病學(xué)調(diào)查。
  1.利用免疫沉淀技術(shù)分析找出羊無漿體感染實驗動物前后抗體變化的差異

3、蛋白條帶,通過質(zhì)譜鑒定,與基因組數(shù)據(jù)比對,BLAST比對分析,篩選出相似度低于45%的特異性的羊無漿AAAP蛋白。
  2.利用原核表達(dá)載體對羊無漿體AAAP基因進(jìn)行截短表達(dá),純化,經(jīng)Western-blot分析表明重組蛋白與羊無漿體陽性血清具有較好的反應(yīng)性,與綿羊肺炎支原體、山羊支原體山羊亞種、莫氏巴貝斯蟲臨潭株、巴貝斯蟲未定種新疆株、尤氏泰勒蟲、呂氏泰勒蟲的陽性血清無交叉反應(yīng),表明該蛋白適合用作羊無漿體病的診斷抗原。
 

4、 3.以重組的羊無漿體AAAP蛋白為抗原,建立了用于羊無漿體病抗體檢測的間接ELISA方法。通過對597份參考血清(434份陰性血清和163份陽性血清)檢測,經(jīng)MedCalc軟件分析,當(dāng)確定ELISA方法的閾值為6.00%時,其特異性為94.5%,敏感性為91.4%。
  4.應(yīng)用本研究建立的間接ELISA方法對我國23省份54個不同地區(qū)的3138份血清進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示羊無漿體病在我國23個省份均有流行,不同省份羊無漿體的抗體陽

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