溫氏附紅細(xì)胞體對牛血液生化指標(biāo)的影響及雙抗體夾心ELISA、PCR診斷方法的建立.pdf

1、采集自然感染溫氏附紅細(xì)胞體的牛血，用檸檬酸鈉抗凝，制成血壓片和姬姆薩染色的血涂片，光學(xué)顯微鏡下觀察紅細(xì)胞及附紅細(xì)胞體的形態(tài)。附紅細(xì)胞體單個或聚合在一起存在于血漿中，附有附紅細(xì)胞體的紅細(xì)胞發(fā)生變形，姬姆薩染色后附紅細(xì)胞體被染成淡紫色。對采集的血液按其鏡檢感染率進(jìn)行分組，分別測定其一氧化氮(NO)含量、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活力。 結(jié)果顯示，隨著附紅細(xì)胞體感染強(qiáng)度的增加，血漿中相應(yīng)的NO和MDA含量逐漸升高，

2、SOD活力逐漸降低。表明這三種生化指標(biāo)的變化與附紅細(xì)胞體的感染有關(guān)。 無菌采集自然感染附紅細(xì)胞體的抗凝血，通過PBS-T緩沖液洗滌、高速低溫離心和超聲波裂解等方法獲得純化的溫氏附紅細(xì)胞體抗原。將該抗原按常規(guī)方法免疫家兔，制備了兔抗溫氏附紅細(xì)胞體的高免血清。運用辛酸硫酸銨法提取血清中的免疫球蛋白IgG，聚丙烯酰胺(PAGE)垂直板電泳結(jié)果顯示所提取的IgG純度較高，并且此法操作簡便，表明其是一種實用高效的抗體提純方法。 將

3、提取的免疫球蛋白IgG，用過碘酸鈉改良法制備酶標(biāo)抗體，建立了從血液中檢測奶牛溫氏附紅細(xì)胞體抗原的雙抗體夾心ELISA。試驗最佳條件為，抗體最適包被量為156μg/mL，酶標(biāo)抗體最適工作濃度為1：400稀釋，抗原及酶標(biāo)抗體的作用時間分別為37℃1h，封閉液為5﹪犢牛血清，底物顯色時間為15min.對溫氏附紅細(xì)胞體抗原的最低檢出量為6.64μg/mL.全血及帶有附紅細(xì)胞體的紅細(xì)胞與純化抗體反應(yīng)的最大稀釋倍數(shù)分別為1：160和1：40，可按照

4、此濃度檢測血液中的附紅細(xì)胞體抗原。對該方法進(jìn)行特異性阻斷試驗、交叉性試驗和重復(fù)性試驗，結(jié)果表明它是一種特異、靈敏、快速的診斷方法，并適合作群體檢測。 從河北省不同地區(qū)采集奶牛血樣222份，應(yīng)用建立的雙抗體夾心ELISA檢測方法對其進(jìn)行檢測，結(jié)果陽性檢出率為91.0﹪，說明本省奶牛群中溫氏附紅細(xì)胞體感染普遍。本次調(diào)查揭示了河北省牛群尤其是規(guī)?；鲋袦厥细郊t細(xì)胞體的感染情況，從而為牛附紅細(xì)胞體病的綜合防制提供可靠依據(jù)。 本