超廣譜β-內(nèi)酰胺酶亞型CTX-M-1的流行病學(xué)研究和蛋白表達(dá).pdf

1、目的:抗生素的應(yīng)用和細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生是共同發(fā)展的,而細(xì)菌的耐藥機(jī)制中以β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生為最主要原因。而近年來隨著第三、四代β-內(nèi)酰胺類抗生素和酶抑制劑克拉維酸、舒巴坦、三唑巴坦等的聯(lián)用,細(xì)菌面臨雙重選擇壓力,β-內(nèi)酰胺酶發(fā)生了進(jìn)化突變,酶的生物學(xué)結(jié)構(gòu)改變,在酶活性位點(diǎn)上的結(jié)構(gòu)變化使得酶能水解新的β-內(nèi)酰胺類抗生素,產(chǎn)生了超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(Extended-spectrumβ-lactamases,ESBLs)。ESBLs主要由大腸埃

2、希菌和克魯伯屬細(xì)菌產(chǎn)生,大多數(shù)由TEM-1、TEM-2、SHV-1在104、164、238和240位點(diǎn)發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變而形成,酶活性部位的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,擴(kuò)大了水解底物范圍,從而增加了對氧亞氨基類抗生素的親和力和水解能力。ESBLs目前已發(fā)現(xiàn)至少387種基因型:TEM型155種、SHV型91種、OXA型88種、CTX型53種,而且新的種類還在不斷的發(fā)展和發(fā)現(xiàn)中。不同基因型的來源不同,分布不同,分子構(gòu)型也有較大區(qū)別,因此其耐藥性

3、也有不同特性。CTX-M型是主要的非TEM/SHV型ESBLs,其特點(diǎn)是對頭孢噻肟(CTX)水解活性高,對頭孢他啶水解活性低。1990年德國的Bauernfeind等首次報(bào)道后迄今已發(fā)現(xiàn)30余種,主要由大腸埃希菌、鼠傷寒沙門菌、變形桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌等細(xì)菌產(chǎn)生,各亞型之間結(jié)構(gòu)基因編碼區(qū)核苷酸序列差異較大,同源性介于71％-99％,pI7.5~8.9。CTX-M型ESBLs主要流行于歐洲、南美洲、中東、遠(yuǎn)東和中國等地區(qū),國內(nèi)關(guān)于ESBLs鑒

4、定到型別的報(bào)告在近幾年內(nèi)有所增多,研究表明我國主要的ESBLs類型為CTX-M型。但國內(nèi)對于CTX-M型ESBLs的研究還不夠深入,多數(shù)僅限于本地區(qū)流行亞型及其耐藥性的總結(jié),不能有效地發(fā)現(xiàn)其耐藥特點(diǎn),從而無法指導(dǎo)臨床用藥。本研究采用PCR方法,有目的地?cái)U(kuò)增CTX-M型基因片段,經(jīng)轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、測序、表達(dá)蛋白等步驟,為進(jìn)一步深入研究其耐藥特點(diǎn)、指導(dǎo)臨床用藥從而降低耐藥性的發(fā)生奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　材料與方法:自2006年7月到20

5、07年7月收集臨床分離大腸埃希氏菌標(biāo)本和克魯伯菌,均來自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院,經(jīng)雙紙片協(xié)同試驗(yàn)初篩、E-test確證,ESBLs陽性菌為27株,提取陽性菌混合物的質(zhì)粒DNA,采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR),用CTX-M-1、CTX-M-14、CTX-M-25、CTX-M-31四對引物擴(kuò)增CTX-M部分亞型,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果后,膠回收目的片段,用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切,連接pET28(a+)載體,構(gòu)建原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化

6、大腸桿菌BL-21感受態(tài)細(xì)胞,提取重組質(zhì)粒并測序,分析其堿基序列,證實(shí)其為目的基因片段,用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)蛋白。
　　結(jié)果:對27株ESBLs陽性的大腸埃希氏菌標(biāo)本和克魯伯菌混合培養(yǎng)物提取質(zhì)粒,使用CTX-M亞型的四對引物擴(kuò)增基因片段,CTX-M-1擴(kuò)增結(jié)果陽性,其余為陰性,陽性片段在Marker907bp處;PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶Bam