CTX-M-14型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的克隆表達(dá)及酶動力學(xué)研究.pdf

1、目的： 研究CTX-M-14型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)在大腸埃希菌中的克隆，表達(dá)，純化，以及酶動力學(xué)。應(yīng)用變性高效液相色譜技術(shù)(DHPLC)與定點(diǎn)突變相結(jié)合的技術(shù)對CTX-M-14型ESBLs基因型進(jìn)行篩選，初步探索該技術(shù)在檢測超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的基因突變中的應(yīng)用。 方法： 1.CTX-M-14在大腸埃希菌中的克隆與表達(dá)通過PCR方法擴(kuò)增溫州地區(qū)已知產(chǎn)CTX-M-14型ESBLs菌株后將其連接在pE

2、T28a質(zhì)粒載體上，轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌BL21，得到CTX-M-14工程菌。將該工程菌誘導(dǎo)表達(dá)，優(yōu)化其誘導(dǎo)條件。鑒定后用His抗體及其二抗對重組蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)檢測。 2.CTX-M-14的發(fā)酵，純化及酶動力學(xué)研究將CTX-M-14工程菌發(fā)酵，得到大量菌體后進(jìn)行親和層析蛋白純化以便得到純度較高的CTX-M-14重組蛋白，分析其純度和比活性。通過CTX-M-14型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶動力學(xué)分析，檢測

3、該酶對多種抗生素的降解能力。 3.應(yīng)用DHPLC與定點(diǎn)突變相結(jié)合的技術(shù)對CTX-M-14型ESBLs基因型進(jìn)行檢測通過PCR方法擴(kuò)增溫州地區(qū)ESBLs菌株，運(yùn)用DHPLC技術(shù)進(jìn)行檢測，將CTX-M-14工程菌進(jìn)行定點(diǎn)突變使其作為DHPLC方法的陽性對照。 結(jié)果： 1.CTX-M-14在大腸埃希菌中的克隆與表達(dá)CTX-M-14基因成功克隆到pET28a質(zhì)粒載體上并在大腸埃希菌BL21中成功表達(dá)。通過Weste

4、rn blot檢測可知該重組蛋白有His標(biāo)簽。 2.CTX-M-14的發(fā)酵，純化及酶動力學(xué)研究工程菌株通過發(fā)酵得到了250g菌體。純化后得到了純度為90％以上的重組蛋白。酶動力學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示CTX-M-14型ESBLs能快速降解頭孢噻肟，Km值為105.68。濃度為3.43mg/ml的重組蛋白取1ml以頭孢噻肟為底物測得酶活力為53IU，比活為15.5IU/mg。 3.應(yīng)用DHPLC與定點(diǎn)突變相結(jié)合的技術(shù)對CTX-M-1