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文檔簡(jiǎn)介
1、研究目的:
構(gòu)建LRG47/Rv2031c共表達(dá)重組慢病毒載體疫苗,使其能在巨噬細(xì)胞(MΦ)中特異性表達(dá)自噬誘導(dǎo)蛋白LRG47和結(jié)核分枝桿菌(MycobacteriumtuberculosisMtb)持留狀態(tài)下特異表達(dá)的免疫優(yōu)勢(shì)抗原Rv2031c。然后從分子、細(xì)胞水平探討其殺傷Mtb的效果及相關(guān)機(jī)制。
研究方法:
1.采用PCR的方法擴(kuò)增出Rv2031c編碼基因和2031-LRG47基因片段,分別克隆入含巨
2、噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pLenti-146-GFP中,構(gòu)建重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pLenti-2031和pLenti-2031-LRG47,構(gòu)建成功后采用限制性?xún)?nèi)切酶酶切和測(cè)序法進(jìn)行鑒定。
2.分別將重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pLenti,pLenti-146-GFP,pLenti-2031和pLenti-2031-LRG47與慢病毒包裝質(zhì)粒pMD2G,pSPAX2以一定比例共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,72h后收集相應(yīng)的病毒顆粒,并用
3、超濾離心管濃縮法濃縮所收集的病毒顆粒,獲得重組慢病毒LV-Lenti,LV-Lenti-146-GFP,LV-Lenti-2031,LV-Lenti-2031-LRG47。然后通過(guò)流式細(xì)胞儀的方法檢測(cè)LV-Lenti-146-GFP感染RAW264.7細(xì)胞后GFP陽(yáng)性細(xì)胞的比例來(lái)獲取所包裝慢病毒的滴度,以確定后續(xù)研究中慢病毒感染的最適滴度。
3.將重組慢病毒LV-Lenti-146-GFP感染RAW264.7細(xì)胞,分別于感染后
4、的24h,48h,72h,96h在熒光顯微鏡下觀(guān)察綠色熒光的表達(dá)情況,以選擇重組慢病毒感染RAW264.7細(xì)胞的最佳時(shí)間點(diǎn),用于后續(xù)研究。并在選擇的最佳時(shí)間點(diǎn)通過(guò)熒光定量PCR和Western-blot的方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞內(nèi)Rv2031c和LRG47的表達(dá)情況。
4.采用上述重組慢病毒感染RAW264.7細(xì)胞,72h后以MOI=5:1的比例分別感染H37RV和H37RV-GFP,感染4h后洗去未被巨噬細(xì)胞吞噬的菌并以此為0h,采
5、用流式細(xì)胞法檢測(cè)0h時(shí)巨噬細(xì)胞吞噬H37Rv-GFP的水平,然后分別在H37RV感染后的不同時(shí)間點(diǎn)用0.1%SDS裂解細(xì)胞,稀釋后涂于7H10固體平板,待菌落生長(zhǎng)后計(jì)數(shù),以檢測(cè)重組慢病毒對(duì)巨噬細(xì)胞殺傷Mtb能力的影響。
5.采用上述重組慢病毒感染RAW264.7細(xì)胞,72h后進(jìn)行以下指標(biāo)的檢測(cè),以探討其對(duì)巨噬細(xì)胞影響的可能機(jī)制:(1)通過(guò)Western-blot的方法檢測(cè)細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)情況,采用Cyto-IDAu
6、tophagyDetectionKit試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞的自噬水平。(2)通過(guò)免疫熒光的方法在激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察Mtb與溶酶體的共定位情況。(3)采用流式細(xì)胞法檢測(cè)巨噬細(xì)胞表面MHCII,CD80的表達(dá)水平。
6.采用OVA致敏BALB/c小鼠,用于制備OVA致敏淋巴細(xì)胞。采用上述重組慢病毒感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,48小時(shí)后加入OVA進(jìn)行抗原荷載,72小時(shí)后加入OVA致敏的小鼠脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行混合培養(yǎng),然后分別于混合培養(yǎng)后不同
7、時(shí)間檢測(cè)淋巴細(xì)胞的增殖和活化水平,以探討重組慢病毒對(duì)巨噬細(xì)胞抗原提呈能力的影響。
研究結(jié)果:
1.酶切和測(cè)序結(jié)果顯示,重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pLenti-2031和pLenti-2031-LRG47構(gòu)建成功。
2.重組慢病毒LV-Lenti,LV-Lenti-146-GFP,LV-Lenti-2031,LV-Lenti-2031-LRG47包裝成功,且通過(guò)檢測(cè)滴度在1-2×107TU/ml以上,可用于后續(xù)的研究
8、。重組慢病毒GFP表達(dá)時(shí)相的觀(guān)察結(jié)果顯示重組慢病毒感染RAW264.7細(xì)胞的最佳時(shí)間點(diǎn)為72h。
3.熒光定量PCR和Western-blot的檢測(cè)結(jié)果證實(shí)重組慢病毒攜帶的重組基因Rv2031c和LRG47均可在RAW264.7細(xì)胞中有效表達(dá)。
4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)荷菌量檢測(cè)結(jié)果表明,重組慢病毒感染不會(huì)顯著影響巨噬細(xì)胞對(duì)結(jié)核分枝桿菌的吞噬能力,但與對(duì)照組相比,LV-Lenti-2031-LRG47可顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)M
9、tb的殺傷功能。
5.與對(duì)照組相比,LV-Lenti-2031-LRG47可以顯著提高巨噬細(xì)胞的自噬水平,促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)Mtb與溶酶體的融合。
6.與對(duì)照組相比,LV-Lenti-2031-LRG47可以顯著提高巨噬細(xì)胞表面MHCⅡ和CD80的表達(dá)水平。同時(shí),混合細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示,LV-Lenti-2031-LRG47感染可顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞活化淋巴細(xì)胞的能力。
結(jié)論:
1.本研究成功構(gòu)建了LRG4
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