免疫性前列腺炎組織Th17T淋巴細(xì)胞浸潤及其相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　 本實驗運用文獻(xiàn)介紹的EAP模型制作方法,應(yīng)用C57BL/6小鼠制作免疫性前列腺炎動物模型,運用一步法實時定量RT-PCR方法檢測EAP前列腺組織Th17輔助性T淋巴細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子包括IL17、IL23p19和IL23p40等的表達(dá)情況；并應(yīng)用免疫組化方法,檢測EAP小鼠前列腺組織中Th17淋巴細(xì)胞浸潤狀況,從而闡明Th17淋巴細(xì)胞與小鼠免疫性前列腺炎發(fā)病之間的關(guān)系,為慢性前列腺炎發(fā)病的免疫機(jī)制及其治療

2、措施的研究提供理論依據(jù)。
　　 本研究共分為三部分進(jìn)行:
　　 一、C57BL/6小鼠實驗性免疫性前列腺炎(EAP)模型的制作；
　　 二、免疫性前列腺炎組織Th17輔助性T淋巴細(xì)胞浸潤狀況免疫組化研究；
　　 三、免疫性前列腺炎組織Th17輔助性T淋巴細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)研究。
　　 第一部分 C57BL/6小鼠EAP模型制作
　　 方法:
　　 C57BL/6小鼠作為模型動物,

3、40只,清潔級,隨機(jī)分為兩組,各20只,一組為免疫性前列腺炎癥組(EAP組),一組為對照組。
　　 應(yīng)用Wistar大鼠前列腺組織蛋白提純夜作為免疫原,調(diào)節(jié)蛋白濃度至2mg/ml；小鼠水合氯醛腹腔注射麻醉后,每只小鼠多點皮下注射前列腺蛋白提純夜0.5ml,同時腹腔注射CFA0.5ml與百白破疫苗0.1ml,分別在0,30天免疫注射兩次；首次免疫后60天,再將炎癥組和對照組小鼠分別隨機(jī)各分為兩組,即將炎癥組小鼠隨機(jī)分為兩組,一組8

4、只,用于RT-PCR檢測；一組為12只,用于前列腺組織淋巴細(xì)胞浸潤的免疫組化研究；對照組小鼠同樣分為兩組,各為8只和12只,分別用于RT-PCR與免疫組化檢測。
　　 小鼠10％水合氯醛腹腔注射麻醉(0.03ml/10g),手術(shù)切取前列腺,用于RT-PCR檢測的炎癥組和對照組各8只小鼠的前列腺分為兩部分,一部分大約為前列腺體積的1/4,用4％多聚甲醛固定,待用于HE染色,檢測前列腺組織內(nèi)炎癥細(xì)胞的浸潤狀況；余部分前列腺組織液氮冷

5、凍后轉(zhuǎn)于-80℃低溫冰箱保存,留待行RT-PCR檢測Th17淋巴細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子表達(dá)情況；用于免疫組化的炎癥組和對照組各12只小鼠,前列腺組織4％多聚甲醛固定24小時,30％蔗糖沉糖后,轉(zhuǎn)于-80℃低溫冰箱保存,留待行冰凍切片免疫組化,檢測CD4+、CD8+、Th17淋巴細(xì)胞在前列腺組織內(nèi)的浸潤狀況,同時行HE染色檢測炎癥細(xì)胞的浸潤情況。
　　 結(jié)果:
　　 1小鼠前列腺大體形態(tài)觀察
　　 首次免疫后60天,手

6、術(shù)切取小鼠前列腺。炎癥組小鼠前列腺與周圍組織嚴(yán)重枯連,不易分離,前列腺組織可見充血、水腫；對照組小鼠前列腺與周圍組織無粘連,無充血,手術(shù)分離容易。
　　 兩組小鼠體重比較:對照組小鼠體重22.7～26.1g,平均25.0±2.2g；炎癥組小鼠體重21.7～28.3g,平均23.7±1.9g；兩組比較t=1.6,p＞0.05,差別無統(tǒng)計學(xué)意義；
　　 兩組小鼠前列腺重量比較:對照組小鼠前列腺重量23.2～33.5mg,平均

7、28.5±3.9 mg；炎癥組小鼠前列腺重量26.1～42.3mg,平均32.7±5.4mg；兩組比較t=-1.5,p>0.05,差別無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 兩組小鼠前列腺指數(shù)(前列腺重/小鼠體重)比較:對照組小鼠前列腺指數(shù)0.0008～0.0014,平均0.0011±0.0002；炎癥組小鼠前列腺指數(shù)0.0012～0.0018,平均0.0014±0.0001；兩組比較t=-2.6,p<0.05,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　

8、 2小鼠前列腺組織病理學(xué)觀察
　　 小鼠前列腺組織冰凍切片,厚度5μm,HE染色,光學(xué)顯微鏡觀察組織病理學(xué)改變。炎癥組小鼠前列腺可見輕重不同的炎癥細(xì)胞浸潤,浸潤炎癥細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞等,以間質(zhì)、血管周圍浸潤明顯；部分腺泡可見擴(kuò)張、腺體結(jié)構(gòu)破壞等。對照組小鼠前列腺組織結(jié)構(gòu)正常,未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤。
　　 第二部分免疫性前列腺炎組織Th17輔助性T淋巴細(xì)胞浸潤狀況免疫組化研究
　　 方法:

9、　　 取冰凍保存(已經(jīng)4％多聚甲醛固定)的小鼠前列腺組織,冰凍切片機(jī)連續(xù)切片,厚度5μm,貼片、吹干、4％多聚甲醛固定,按照SABC試劑盒說明書步驟,行免疫組化檢測。結(jié)果判斷以淋巴細(xì)胞胞漿和/或胞膜棕黃色著色并高于背景色為陽性,每張載玻片隨機(jī)選取5個高倍視野,計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)量,取其均值作為陽性細(xì)胞數(shù)。
　　 結(jié)果:
　　 免疫組化檢測結(jié)果:CD4、CD8、IL17三種標(biāo)記在對照組和炎癥組前列腺組織淋巴細(xì)胞均有表達(dá),炎癥

10、組明顯高于對照組。
　　 CD4陽性細(xì)胞數(shù)量:對照組小鼠前列腺組織切片每高倍視野1.0～4.4個,平均2.4±1.1個；炎癥組小鼠前列腺組織切片每高倍視野5.6～12.7個,平均9.1±2.1個；兩組比較,t=9.7,p<0.05,差別具有統(tǒng)計學(xué)意義；
　　 CD8陽性細(xì)胞數(shù)量:對照組小鼠前列腺組織切片每高倍視野0.2～1.4個,平均0.8±0.3個；炎癥組小鼠前列腺組織切片每高倍視野2.7～6.8個,平均4.8±1.3

11、個；兩組比較,t=10.4,p<0.05,差別具有統(tǒng)計學(xué)意義；
　　 IL17陽性細(xì)胞數(shù)量:對照組小鼠前列腺組織切片每高倍視野0.3～5.1個,平均2.3±1.8個；炎癥組小鼠前列腺組織切片每高倍視野3.2～8.2個,平均5.7±1.8個；兩組比較,t=4.7,p<0.05,差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 第三部分免疫性前列腺炎組織Th17T淋巴細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)研究
　　 方法:
　　 取低溫保存的小鼠前

12、列腺組織約20mg,運用RNAprep pure動物組織總RNA提取試劑盒(離心柱型)說明書所列實驗步驟進(jìn)行操作,提取前列腺組織總RNA；提取的總RNA濃度為118ng/μ1,純度為1.95,符合RT-PCR檢測要求；運用SYBR GreenⅠ一步嵌合熒光法實時定量RT-PCR檢測前列腺組織Th17淋巴細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL17、IL23p19、IL23p40等mRNA的表達(dá)；應(yīng)用2-△cr表示各個細(xì)胞因子mRNA相對表達(dá)量。
　　

13、 結(jié)果:
　　 IL17、IL23p19、IL23p40等mRNA的表達(dá)相對含量結(jié)果:
　　 對照組小鼠前列腺組織IL17相對含量為0.0005～0.0081,平均0.0036±0.0029；炎癥組小鼠前列腺組織IL17相對含量為0.0221～0.0980,平均0.0530±0.0265:組間比較t=-4.5,p<0.05,差別具有統(tǒng)計學(xué)意義；
　　 對照組小鼠前列腺組織IL23p19相對含量為0.0008～0

14、.0092,平均0.0051±0.0025；炎癥組小鼠前列腺組織IL23p19相對含量為0.0107～0.0258,平均0.0177±0.0065；組間比較t=-4.5,p<0.05,差別具有統(tǒng)計學(xué)意義；
　　 對照組小鼠前列腺組織IL23p40相對含量為0.0002～0.0072,平均0.0041±0.0028:炎癥組小鼠前列腺組織IL23p40相對含量0.0092～0.0861,平均為0.0289±0.0283；組間比較t=

15、-2.1,p<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 運用前列腺組織蛋白提純液作為免疫原免疫C57BL/6小鼠成功制作免疫性前列腺炎模型；
　　 1、小鼠免疫性前列腺炎組織Th17相關(guān)的細(xì)胞因子mRNA表達(dá)增高,前列腺組織內(nèi)浸潤的IL17+細(xì)胞明顯增多,說明Th17淋巴細(xì)胞參與了免疫性前列腺炎的發(fā)病過程；
　　 2、研究與Th17淋巴細(xì)胞有關(guān)的治療方法可能有助于慢性前列腺炎治療研究。