肝臟缺血再灌注所致腦損傷及機(jī)制的探討.pdf

1、自上世紀(jì)六十年代初首次肝移植成功以來，肝移植的開展已有近四十年的歷史，隨著手術(shù)技巧的不斷改善，免疫抑制治療方案的不斷完善，及人們對(duì)缺血再灌注損傷的認(rèn)識(shí)，肝移植的成功率逐步增加。但是術(shù)后并發(fā)癥仍不斷發(fā)生。隨著肝移植病人的增多，其術(shù)后并發(fā)癥日益受到關(guān)注，肝移植所致遠(yuǎn)隔器官損傷是目前研究的熱點(diǎn)之一。肝移植術(shù)后神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥發(fā)生率高達(dá)8～47％，平均在20％左右，并以術(shù)后早期多見，嚴(yán)重影響手術(shù)的成功和病人的康復(fù)。 導(dǎo)致移植術(shù)后神經(jīng)系統(tǒng)并

2、發(fā)癥的原因可能涉及多方面，其中包括代謝失調(diào)、手術(shù)創(chuàng)傷、應(yīng)激、肝臟的缺血再灌注損傷、肝臟疾病晚期對(duì)腦的損害、術(shù)后排斥反應(yīng)影響肝功能的恢復(fù)及免疫抑制劑的應(yīng)用等。目前關(guān)于移植術(shù)后神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制尚不明確。肝臟缺血再灌注損傷是肝移植過程中一重要的病生過程，它不僅造成肝臟局部的損害，同時(shí)激活網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)釋放大量的炎性介質(zhì)，從而引起遠(yuǎn)隔器官如肺、腎、腸等的損傷。那么這一過程是否會(huì)導(dǎo)致腦組織結(jié)構(gòu)的病理改變，移植術(shù)后神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥是否與此過程有

3、關(guān)目前尚無報(bào)道。本研究擬通過建立大鼠脾靜脈-股靜脈轉(zhuǎn)流下全肝缺血再灌注的模型，觀察肝臟再灌注后大鼠腦組織超微結(jié)構(gòu)的改變，并從細(xì)胞、分子和基因水平上探討其可能的機(jī)制；同時(shí)在肝移植患者中證實(shí)是否有亞臨床腦損傷及與其它相關(guān)因素的關(guān)系，為臨床加強(qiáng)肝移植術(shù)中腦保護(hù)，減少術(shù)后神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥提供理論參考依據(jù)。本研究分為三個(gè)方面，四個(gè)部分，包括：第一：大鼠肝臟缺血再灌注后所致腦組織的超微結(jié)構(gòu)的改變；第二：大鼠肝臟缺血再灌注后所致腦組織超微結(jié)構(gòu)改變的機(jī)制

4、探討：1.誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的mRNA表達(dá)在肝臟缺血再灌注所致腦損傷中的作用；2.緊密連接在肝臟缺血再灌注后所致血腦屏障通透性改變中的作用；第三：肝移植患者血清中S-100β蛋白濃度變化及原因的探討。 實(shí)驗(yàn)材料與方法實(shí)驗(yàn)材料1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康雄性Wistar大鼠，體重240-280g。 2.主要試劑及藥品：MDA、SOD、NO試劑盒(南京建成生物制品研究所)，抗NT一抗(美國CAYMAN)，抗occludin一抗(美國S

5、antaCruze)，抗ZO-1一抗(美國CHEMICON)，RNA裂解液、總RNA提取試劑盒(上海華美生物工程公司產(chǎn)品)，TaKaRa試劑盒及DNAMarker由大連寶生物公司提供，iNOS、occludin引物、內(nèi)參照β-actin由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。S-100β(大連泛邦生化)和IL-1β上海申雄產(chǎn)品。 3.自制小型轉(zhuǎn)流泵：克服5cmH2O阻力提供2-10ml·min-1流量。 4.主要儀器：西門子Si

6、recust730監(jiān)護(hù)儀(德國)，飛利普CM-10型透射電鏡，超薄切片機(jī)8800型(瑞典)，s-500p紫外光可見光連續(xù)分光光度計(jì)(法國)，通用BIO-RADPowerPac200電泳儀，半干轉(zhuǎn)印儀(美國)，水平搖床，小型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國)，自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀，PTR-100PCR擴(kuò)增儀(美國)，KODAKID型凝膠成像分析系統(tǒng)(美國)。 實(shí)驗(yàn)方法一、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分1.動(dòng)物模型雄性Wistar大鼠，10％的水合氯醛3m

7、l·kg-1腹腔注射麻醉后，參照Suzuki門體分流的方法，通過夾閉肝門建立大鼠脾靜脈-股靜脈轉(zhuǎn)流下全肝缺血再灌注模型。 2.實(shí)驗(yàn)分組S組：假手術(shù)組，僅開腹分離肝動(dòng)脈、門靜脈和膽管，游離脾靜脈，40min后切脾，關(guān)腹。 IR3組：全肝缺血40min后再灌注3h。 IR6組：全肝缺血40min后再灌注6h。 IR24組：全肝缺血40min后再灌注24h。 3.觀察指標(biāo)和方法1)圍缺血期血液動(dòng)力學(xué)變化

8、；2)再灌注6h肝組織及腦組織病理檢查(光鏡)；腦組織超微結(jié)構(gòu)的檢查(電鏡)； 3)血中MDA及NO濃度，腦組織MDA、SOD及NO的變化(化學(xué)法)； 4)血腦屏障通透性改變(比色法)； 5)腦組織中NT、ZO-1和occludin蛋白表達(dá)(Westernblot法)； 6)腦組織iNOS和occludinmRNA表達(dá)的變化(RT-PCR法)； 二、臨床觀察部分1病例采集：本院臨床肝功終末期進(jìn)行肝

9、移植的患者2監(jiān)測(cè)指標(biāo)及方法：術(shù)前，無肝期末，供肝移植后1小時(shí)，24小時(shí)，48小時(shí)血中的S-100β和IL-1β濃度(雙抗體夾心-ELAISA法)；術(shù)前，阻斷前，無肝期10min、30min、60min，肝臟再灌注后10min、90min及術(shù)畢的HR、MAP、CO、CVP和血?dú)夥治觥?實(shí)驗(yàn)結(jié)果一、大鼠肝臟缺血再灌注后所致腦組織的超微結(jié)構(gòu)改變1.圍缺血期血液動(dòng)力學(xué)變化：S組在缺血和再灌注期血液動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定，而IR組在缺血期MAP在60

10、-80mmHg，與夾閉前和假手術(shù)組比均有降低(P＜0.05)。再灌注后IR組有一過性血壓下降，心率增快。 2.光鏡檢查：肝組織：再灌注6h后可見肝竇內(nèi)淤血，肝細(xì)胞可見不同程度的腫脹變性，并有局灶或片狀壞死，壞死灶有粒細(xì)胞浸潤(rùn)。 腦組織：再灌注6h后皮層組織神經(jīng)細(xì)胞層次欠清晰，血管周圍和細(xì)胞周圍的空隙較正常略寬。 3.電鏡檢查：可見再灌注后6h腦組織水腫，以膠質(zhì)細(xì)胞和毛細(xì)血管周為重，形成寬帶，膠質(zhì)細(xì)胞變性；毛細(xì)血管

11、基底膜疏電子性，內(nèi)皮細(xì)胞變性只見輪廓，外周膠質(zhì)細(xì)胞突起內(nèi)水腫，有少數(shù)變性線粒體。神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞變性，僅見細(xì)胞和細(xì)胞器的輪廓。 二、大鼠肝臟缺血再灌注后所致腦組織的病理結(jié)構(gòu)改變的機(jī)制探討1.誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的mRNA表達(dá)在肝臟缺血再灌注所致腦損傷中的作用 血清和腦組織中NO的含量于肝臟再灌注6小時(shí)明顯升高(p＜0.01)，24小時(shí)后血清中NO雖仍稍高于S組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而腦組織的NO仍高于S組(p＜0.05)；

12、再灌注6h和24h腦組織中NT蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯增加(p＜0.05，p＜0.01)；肝臟再灌注后6h腦組織中iNOSmRNA表達(dá)較S組顯著增多(p＜0.05)，24h后腦組織中仍有表達(dá)。再灌注6h后腦組織內(nèi)MDA含量明顯增加，而SOD活力明顯降低(p＜0.05)。同時(shí)血中MDA也顯著增加(p＜0.05)。 2.緊密連接在肝臟缺血再灌注后所致血腦屏障通透性改變中的作用肝臟缺血再灌注6hEB在腦組織中的含量與S組和1R3組比較顯著

13、增高，并持續(xù)至24h；同時(shí)可見occludin蛋白表達(dá)明顯減少，并以β帶表達(dá)降低為主，但24小時(shí)α和β均減少。ZO-1蛋白表達(dá)各組均較S組逐漸減少(p＜0.05)；occludingmRNA的表達(dá)于肝臟再灌注后3h就已減少，并逐漸降低，24h表達(dá)顯著降低，低于IR3組、IR6組。 三、肝移植患者血清中S-100β蛋白濃度變化及原因的探討S100-β術(shù)前均在正常范圍，新肝期1h明顯增高，至24h仍高于術(shù)前水平，最高值為1.28μg

14、·ml-1，48h降至無肝期末水平。IL-1β于新肝期24h升至最高水平，其后又降低；腔靜脈阻斷后最初10minMAP明顯降低，HR增快，隨后經(jīng)藥物調(diào)整MAP維持在正常水平，心率略有下降但仍高于阻斷前水平，CO明顯降低；再灌注后最初10minMAP再次降低，CO仍舊低于術(shù)前水平，HR恢復(fù)正常，CVP略有增高；后經(jīng)血管活性藥利尿劑等治療逐漸恢復(fù)至術(shù)前水平；血中二氧化碳分壓在新肝早期明顯升高，無肝期末及新肝早期雖然應(yīng)用了碳酸氫鈉注射液但PH

15、值仍有降低，呈酸血癥，術(shù)畢前恢復(fù)正常；離子經(jīng)過調(diào)整基本均在正常范圍。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)S-100β的變化與CO和IL-1β無明顯相關(guān)，(r=-0.327，r=0.248，p＞0.05)。 結(jié)論1.肝臟缺血再灌注不僅可以引起肝組織的損傷同時(shí)還可以導(dǎo)致腦組織的超微結(jié)構(gòu)的改變。 2.肝臟缺血再灌注后，腦組織中iNOS-mRNA表達(dá)上調(diào)，產(chǎn)生大量的NO，通過OONO-介導(dǎo)損傷腦組織。 3.肝臟缺血再灌注后血腦屏障通透性增加。