胎膜早破危險(xiǎn)因素及BV菌群檢測(cè)方法的研究.pdf

1、研究背景 胎膜早破(premature rupture of fetal membranes，PROM)是指在臨產(chǎn)前胎膜破裂，國(guó)內(nèi)發(fā)生率占分娩總數(shù)的2.7％～17％，國(guó)外為5％～15％，而且近年來(lái)其發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)。胎膜早破一方面容易導(dǎo)致孕產(chǎn)婦宮內(nèi)感染、產(chǎn)褥感染、難產(chǎn)，增加羊水栓塞的機(jī)率，另一方面誘發(fā)宮內(nèi)窘迫、臍帶脫垂、胎嬰兒感染和早產(chǎn)等。研究報(bào)道，約30％～40％的胎膜早破可并發(fā)早產(chǎn)，臨床上有近1/3的早產(chǎn)被證實(shí)由此引起，

2、從而增加了圍生期母嬰各種并發(fā)疾病的發(fā)病率和死亡率。 生殖道感染、吸煙、微量元素與維生素缺乏等是胎膜早破的危險(xiǎn)因素，其中生殖道病原微生物上行性感染是引起胎膜早破的主要原因。常見的病原體有β-溶血性鏈球菌、淋球菌、沙眼衣原體及某些厭氧菌等。病原體經(jīng)宮頸口感染胎膜，也可經(jīng)血行播散至子宮、胎盤，發(fā)生羊膜炎、絨毛膜羊膜炎。生殖道感染中亟待解決的問(wèn)題是細(xì)菌性陰道病(bacterial vaginosis，BV)菌群分類與胎膜早破的關(guān)系。隨著

3、經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和城市化進(jìn)程的加快，人們的生活水平有了提高，但同時(shí)也帶來(lái)了微環(huán)境的污染。研究發(fā)現(xiàn)室內(nèi)裝修與自然流產(chǎn)和胎兒畸形等有關(guān)聯(lián)，但與胎膜早破是否有關(guān)尚未見報(bào)道。 研究目的 采用傳統(tǒng)流行病學(xué)和分子流行病學(xué)方法，探討與胎膜早破發(fā)生有關(guān)聯(lián)的危險(xiǎn)因素。通過(guò)病例對(duì)照研究、分子流行病學(xué)和基因．環(huán)境交互作用分析，從易感基因和環(huán)境因素兩方面分析胎膜早破的危險(xiǎn)因素，并建立不依賴培養(yǎng)16S rRNAPCR-DGGE檢測(cè)BV菌群分類方法，為胎

4、膜早破防治提供科學(xué)依據(jù)。 研究方法 1.胎膜早破危險(xiǎn)因素研究采用前瞻性隊(duì)列觀察方法，從妊娠開始建立觀察隊(duì)列，跟蹤隨訪至分娩。對(duì)2006年4月至2007年11月在濟(jì)南市婦幼保健院孕期保健并分娩的婦女，進(jìn)行問(wèn)卷調(diào)查和隨訪檢查記錄，收集孕婦及胎兒的監(jiān)測(cè)資料。調(diào)查內(nèi)容包括孕婦的一般特征，婦科和孕期檢查記錄，分娩情況，生殖道感染情況，孕婦、丈夫煙酒和接觸毒物情況(妊娠期住在新裝修房間的時(shí)間)及流產(chǎn)史等。描述監(jiān)測(cè)孕產(chǎn)婦的流行病學(xué)特征

5、。以發(fā)生胎膜早破者作為指示病例組，以未發(fā)生并發(fā)癥者(包括胎膜早破)作為指示對(duì)照組，應(yīng)用非條件Logistic回歸分析胎膜早破發(fā)生的危險(xiǎn)因素。 2.易感基因與胎膜早破關(guān)聯(lián)研究采集研究對(duì)象的靜脈血提取DNA，采用PCR-RFLP法檢測(cè)維生素D受體(Vitamin D receptor,VDR)和白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)基因多態(tài)性； 采用焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)亞甲基四氫葉酸還原酶(Methylene

6、tetrahydrofolatereductase，MTHFR)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase，MMPs)的基因多態(tài)性。以基因野生型純合子為比較的基線(OR=1.0)，采用Logistic回歸分析突變基因與胎膜早破的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度(OR)。將基因與其他危險(xiǎn)因素(生殖道感染、BV、被動(dòng)吸煙、室內(nèi)裝修)相結(jié)合，分析環(huán)境．基因間的交互作用。 3.細(xì)菌性陰道病菌群檢測(cè)方法的研究采集陰道分泌物提取微生物的

7、：DNA；使用針對(duì)細(xì)菌保守區(qū)設(shè)計(jì)的通用引物(正向引物帶“GC”夾)，對(duì)提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，DGGE電泳對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類，再次PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物純化測(cè)序。測(cè)序結(jié)果使用Vector NTI9.0等軟件進(jìn)行對(duì)接，同時(shí)與Genbank、歐洲核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)和自建的16S rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，按照97.5％同源性標(biāo)準(zhǔn)確定微生物種類。為進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性，建立針對(duì)常見菌株的單一PCR和同時(shí)檢測(cè)多個(gè)已知菌株的多重PCR技術(shù)。 4.統(tǒng)計(jì)

8、學(xué)處理以FOXPRO 8.0建立數(shù)據(jù)庫(kù)，使用SPSS 15.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用相對(duì)數(shù)指標(biāo)，顯著性檢驗(yàn)用x2檢驗(yàn)。采用非條件Logistic回歸分析危險(xiǎn)因素，觀察指標(biāo)為比值比(OR)及其95％可信區(qū)間(95％CI)。 結(jié)論 1.室內(nèi)裝修、生殖道感染、流產(chǎn)史和被動(dòng)吸煙是胎膜早破的危險(xiǎn)因素。 2.單因素分析發(fā)現(xiàn)MTHFR C677T、 MMP-9 C-1562T、VDR TaqI和IL-1β +35

9、93四個(gè)基因位點(diǎn)多態(tài)性與胎膜早破無(wú)顯著性關(guān)聯(lián)。 3.基因-環(huán)境交互作用分析發(fā)現(xiàn)：MMP-9、MTHFR和VDR基因與室內(nèi)裝修有協(xié)同作用；MTHFR和IL-1β基因與被動(dòng)吸煙有協(xié)同作用；IL-1β基因與BV感染之間存在協(xié)同作用，增加了胎膜早破發(fā)生的危險(xiǎn)性。 4.建立了陰道加德納菌、陰道奇異菌和動(dòng)彎桿菌的多重PCR方法；建立了不依賴細(xì)菌培養(yǎng)的16S rRNA-PCR-DGGE對(duì)BV菌群檢測(cè)的新方法，可以對(duì)BV菌群進(jìn)行分類和動(dòng)

10、態(tài)變化監(jiān)測(cè)。多重PCR方法也可以對(duì)PCR-DGGE檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。 意義與創(chuàng)新 1.本研究運(yùn)用傳統(tǒng)流行病學(xué)研究方法，國(guó)內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)妊娠期居住環(huán)境中有害物質(zhì)(苯和甲醛)增加發(fā)生胎膜早破的危險(xiǎn)性。 2.本研究發(fā)現(xiàn)MTHFR C677T、MMP-9 C-1562T、VDR TaqI和IL-1β+3593四個(gè)基因位點(diǎn)多態(tài)性與胎膜早破無(wú)顯著性關(guān)聯(lián)；但基因一環(huán)境交互作用分析發(fā)現(xiàn)與室內(nèi)裝修有協(xié)同作用的基因位點(diǎn)有MTHFR C6

11、77T、VDR TaqI、MMP-9C-1562T；與被動(dòng)吸煙有協(xié)同作用的有MTHFR C677T、IL-1β+3593；與BV感染有協(xié)同作用的基因位點(diǎn)是IL-1β+3593，環(huán)境因素增加了這些基因型攜帶者胎膜早破發(fā)生的危險(xiǎn)性。 3.建立了16S rRNA PCR-DGGE檢測(cè)BV菌群分類方法，并建立了16S rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)，為測(cè)序結(jié)果的比對(duì)分析提供了基礎(chǔ)。該方法可用于BV的快速診斷和菌群分類及動(dòng)態(tài)漂移的監(jiān)測(cè)，為BV有效防治措施