人參皂苷Rb3對血管內(nèi)皮細(xì)胞的類雌激素樣保護(hù)效應(yīng)研究.pdf

1、目的:體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,探索人參皂苷Rb3對ox-LDL所致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制,為具有益氣養(yǎng)陰作用的西洋參莖葉總皂苷的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。
　　方法:取健康產(chǎn)婦分娩的新生兒臍帶,用0.1％膠原酶Ⅰ消化取臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞;分別應(yīng)用含20%FBS、10ng/ml EGF的DMEM培養(yǎng)液和含8%FBS、2%LSGS的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs),觀察其生長情況;0.25%豬胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞傳代培養(yǎng);

2、Ⅷ因子相關(guān)抗原間接免疫染色方法對細(xì)胞進(jìn)行鑒定。以體外培養(yǎng)的HUVECs為研究對象,建立ox-LDL刺激內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型。實驗共分為8個組:正常對照組(NOR)、模型組(MOD)、雌二醇組(E2,0.01μM)、雌二醇+雌激素受體抑制劑ICI182780組(E2I,E2:0.01μM,ICI:1μM)、人參皂苷Rb3低劑量組(RL,1μM)、人參皂苷Rb3中劑量組(RM,10μM)、人參皂苷Rb3高劑量組(RH,100μM)、人參皂苷Rb

3、3中劑量組+雌激素受體抑制劑ICI182780組(RMI,RM:10μM,ICI:1μM),各給藥組,在ox-LDL刺激前,藥物預(yù)處理1小時,加予ICI182780組,在藥物處理前1h給予ICI182780,然后共同作用24h后進(jìn)行檢測。取細(xì)胞培養(yǎng)上清液檢測NO、ET-1、sE-selectins、sICAM-1含量,取細(xì)胞裂解液檢測胞內(nèi)NOS、SOD、MDA水平,提取細(xì)胞總RNA應(yīng)用RT-PCR檢測iNOS和eNOS基因表達(dá)水平,收集

4、細(xì)胞采用流式細(xì)胞儀結(jié)合AnnexinV-FITC/PI雙染色法測定HUVECs凋亡率,Western blot法檢測細(xì)胞Akt、p-Akt、ERK1/2、p-ERK1/2、p38MAPK及p-p38MAPK蛋白水平。
　　結(jié)果:
　?、?.1%膠原酶Ⅰ消化臍靜脈所得原代內(nèi)皮細(xì)胞在接種后約4h開始貼壁生長,光鏡下貼壁生長的內(nèi)皮細(xì)胞可匯合成典型的鋪路石狀,用含8%FBS、2% LSGS的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞可穩(wěn)定傳代至6

5、~7代。Ⅷ因子相關(guān)抗原間接免疫染色法鑒定可見細(xì)胞胞質(zhì)中有棕黃色顆粒,即所培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)Ⅷ因子相關(guān)抗原,為內(nèi)皮細(xì)胞。
　　②氧化損傷的檢測:與NOR相比,MOD組HUVECs SOD活力明顯降低(P?0.01), MDA含量明顯增多(P?0.01);與MOD組比較,E2、RL、RM、RH組HUVECs SOD活力明顯升高(P?0.01或P?0.05),MDA含量明顯降低(P?0.01);運(yùn)用ICI182780預(yù)處理后,與對應(yīng)藥物組相比

6、, HUVECs SOD活力明顯降低(P?0.05),MDA合成明顯增多(P?0.01)。
　?、壑卵滓蜃拥臋z測:與NOR相比,MOD組HUVECs sE-selectin、sICAM-1含量均明顯增多(P?0.01);與MOD組比較,E2、RM、RH組HUVECs sE-selectin含量均明顯降低(P?0.01),RL組無統(tǒng)計學(xué)差異;與MOD組比較,E2、RL、RM、RH組HUVECs sICAM-1含量均明顯降低(P?0.

7、01);運(yùn)用 ICI182780預(yù)處理后,與對應(yīng)藥物組相比, HUVECs sE-selectin、sICAM-1含量均明顯增多(P?0.01);另外,與 RL組相比,RH組HUVECs sICAM-1含量進(jìn)一步降低(P?0.05)。
　?、軆?nèi)皮細(xì)胞功能的檢測:與NOR相比,MOD組HUVECs NOS、NO、ET-1含量及 iNOSmRNA表達(dá)均顯著升高(P?0.01),eNOS mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01);與MOD組

8、比較,E2、RL、RM、RH組HUVECs NOS、NO、ET-1含量及iNOS mRNA表達(dá)均明顯降低(P?0.01),eNOS mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.01);運(yùn)用ICI182780預(yù)處理后,與對應(yīng)藥物組相比,HUVECs NOS、NO、ET-1含量及iNOS mRNA表達(dá)均顯著升高(P?0.01或P?0.05),eNOS mRNA表達(dá)顯著降低(P?0.01或P?0.05)。
　?、菁?xì)胞凋亡的檢測:與NOR相比,MOD組

9、HUVECs早期凋亡細(xì)胞(Annexin V陽性/PI陰性)及晚期凋亡和壞死細(xì)胞(AnnexinV陽性/PI陽性)比率明顯增加(P<0.01);與MOD組比較,E2、RL、RM、RH組HUVECs早期凋亡細(xì)胞比率明顯降低(P<0.01),E2、RM、RH組HUVECs晚期凋亡和壞死細(xì)胞比率明顯降低(P<0.01),RL組無統(tǒng)計學(xué)差異;運(yùn)用ICI182780預(yù)處理后,與對應(yīng)藥物組相比,HUVECs早期凋亡細(xì)胞及晚期凋亡和壞死細(xì)胞比率增加(

10、P<0.01)。
　　⑥雌激素相關(guān)信號通路蛋白的檢測:與NOR組相比,MOD組HUVECs細(xì)胞p-Akt、p-ERK1/2蛋白表達(dá)明顯增高(P?0.01),p-p38MAPK蛋白表達(dá)明顯降低(P?0.01);與MOD組比較,E2、RH、RM組HUVECs細(xì)胞p-Akt蛋白表達(dá)均明顯減少(P?0.05), RL組HUVECs細(xì)胞p-Akt蛋白表達(dá)也呈降低趨勢,但無統(tǒng)計學(xué)意義;與MOD組比較, E2、RH組HUVECs細(xì)胞p-ERK1

11、/2蛋白表達(dá)均明顯減少(P?0.01),RM、RL組HUVECs細(xì)胞p-ERK1/2蛋白表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異;與MOD組比較,E2、RH、RM、RL組HUVECs細(xì)胞p-p38MAPK蛋白表達(dá)均明顯增高(P?0.01);運(yùn)用ICI182780預(yù)處理后,與對應(yīng)藥物組相比,HUVECs細(xì)胞p-Akt、p-ERK1/2蛋白表達(dá)明顯增高(P?0.01或P?0.05),且E2I組細(xì)胞p-p38MAPK蛋白表達(dá)明顯降低(P?0.05);但與RM組相比,

12、RMI組HUVECs細(xì)胞p-p38MAPK蛋白表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)論:
　?、俪晒Ψ蛛x培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,為體外研究血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及藥物保護(hù)機(jī)制提供保障。
　?、谌藚⒃碥誖b3可通過與雌激素受體結(jié)合實現(xiàn)抑制內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)激活、ET-1和NO過度釋放、細(xì)胞凋亡及降低Akt、ERK1/2蛋白磷酸化水平等類雌激素樣血管保護(hù)作用,其作用效應(yīng)較雌激素弱。
　　③人參皂苷Rb3可通過影響p38MAPK介