白藜蘆醇對(duì)小鼠巨噬泡沫細(xì)胞膽固醇外流的影響.pdf

1、研究目的： 1.研究白藜蘆醇對(duì)小鼠腹腔巨噬泡沫細(xì)胞膽固醇外流的影響。 2.探討白藜蘆醇促進(jìn)泡沫細(xì)胞膽固醇外流的可能機(jī)制。 研究方法： 1.小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離、體外培養(yǎng)與巨噬泡沫細(xì)胞模型的建立與鑒定將小鼠(20g～25g)脫頸椎處死，消毒后置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，剝離腹部皮膚。將PBS注入腹腔，輕揉腹部后用無(wú)菌的吸管吸取腹腔內(nèi)PBS液，收集于塑料離心管中，室溫下以3，000rpm離心10min。離心后所得細(xì)胞重懸

2、于RPMI-1640培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度達(dá)2×106個(gè)/ml。用臺(tái)盼藍(lán)染色法觀察細(xì)胞存活率，要超過(guò)95％。將細(xì)胞接種于12孔板，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育3h后沈去未貼壁細(xì)胞，重新于每孔中加入RPMI-1640培養(yǎng)基(含10％FBS)。 用密度梯度離心法分離血漿低密度脂蛋白(LDL)，用硫酸銅氧化修飾成為氧化LDL(ox—LDL)。在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入ox—LDL，使其每孔終濃度為50μg/ml，細(xì)胞置于CO2培養(yǎng)箱中孵

3、育24h，使細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘膳菽?xì)胞。 用熒光酶學(xué)法檢測(cè)巨噬泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇的含量，用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白含量以鑒定巨噬泡沫細(xì)胞模型是否成立。 2.白藜蘆醇對(duì)巨噬泡沫細(xì)胞膽固醇外流的影響10μM、50μM和100μM白藜蘆醇分別培養(yǎng)巨噬泡沫細(xì)胞24h，用MTT法評(píng)價(jià)白藜蘆醇對(duì)巨噬泡沫細(xì)胞的增殖毒性。 用10μM、50μM和100μM白藜蘆醇分別培養(yǎng)巨噬泡沫細(xì)胞24h。熒光酶學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞和培養(yǎng)基中的總膽

4、固醇和游離膽固醇的含量。 用10μM、50μM和100μM白藜蘆醇分別培養(yǎng)巨噬泡沫細(xì)胞0h、12h、24h和36h，再與10μg/mLapoAI孵育24h。熒光酶學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞和培養(yǎng)基中的總膽固醇和游離膽固醇的含量。 3.白藜蘆醇對(duì)巨噬泡沫細(xì)胞ABCA1和ABCG1表達(dá)的影響用10μM、50μM和100μM白藜蘆醇分別培養(yǎng)巨噬泡沫細(xì)胞24h，提取細(xì)胞總RNA，采用熒光定量PCR的方法檢測(cè)ABCA1和ABCG1mRNA的表達(dá)

5、。 4.放線菌素D對(duì)白藜蘆醇誘導(dǎo)ABCA1和ABCG1表達(dá)的影響將防線菌素D(5μg/mL)與100μM白藜蘆醇共同培養(yǎng)巨噬泡沫細(xì)胞24h，采用熒光定量PCR的方法檢測(cè)ABCA1和ABCG1mRNA的表達(dá)。 5.放線菌素D和ABCA1抑制劑對(duì)白藜蘆醇誘導(dǎo)膽固醇外流的影響將放線菌素D(5μg/mL)或DIDS(400μM)分別與100μM白藜蘆醇共同培養(yǎng)巨噬泡沫細(xì)胞24h，再與10μg/mLapoAI孵育24h，熒光酶學(xué)法

6、檢測(cè)細(xì)胞和培養(yǎng)基中總膽固醇和游離膽固醇的含量。 6.白藜蘆醇對(duì)巨噬泡沫細(xì)胞LXRα表達(dá)的影響用10μM、50μM和100μM白藜蘆醇分別培養(yǎng)巨噬泡沫細(xì)胞24h，提取細(xì)胞總RNA，采用熒光定量PCR的方法檢測(cè)LXRαmRNA的表達(dá)。 7.LXRα抑制劑(GGPP)對(duì)白藜蘆醇誘導(dǎo)ABCA1和ABCG1表達(dá)和膽固醇外流的影響用10μMGGPP與100μM白藜蘆醇共同培養(yǎng)巨噬泡沫細(xì)胞24h，采用熒光定量PCR的方法檢測(cè)ABCA1

7、和ABCG1mRNA的表達(dá)。 將10μMGGPP與100μM白藜蘆醇共同培養(yǎng)巨噬泡沫細(xì)胞24h，再與10μg/mLapoAI孵育24h，熒光酶學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞和培養(yǎng)基中總膽固醇和游離膽固醇的含量。 研究結(jié)果： 1.巨噬泡沫細(xì)胞的鑒定用熒光酶學(xué)法檢測(cè)巨噬泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇的含量，與正常對(duì)照組巨噬細(xì)胞相比，用ox—LDL處理巨噬細(xì)胞24h后，細(xì)胞內(nèi)總膽固醇、游離膽固醇和膽固醇酯的含量均明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.

8、05)，說(shuō)明巨噬泡沫細(xì)胞內(nèi)有大量膽固醇的聚積，而且巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯與總膽固醇的比值達(dá)到51.620％，細(xì)胞已經(jīng)泡沫化。 2.白藜蘆醇對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞增殖的影響10μM、50μM和100μM自藜蘆醇作用細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，吸光度值的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)，說(shuō)明該濃度白藜蘆醇對(duì)巨噬細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響，對(duì)巨噬細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用。 3.白藜蘆醇促進(jìn)apoAI誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬泡沫細(xì)胞膽固醇的外流在無(wú)apoAI組

9、，加入各濃度白藜蘆醇培養(yǎng)巨噬泡沫細(xì)胞24h后，膽固醇(包括總膽固醇、游離膽固醇)的外流率有增加的趨勢(shì)，然而差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。 加入apoAI組，與Oh相比，白藜蘆醇培養(yǎng)巨噬泡沫細(xì)胞12h～36h后，膽固醇(包括總膽固醇、游離膽固醇)的外流率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，且在24h時(shí)，膽固醇的外流率達(dá)到最大，總膽固醇外流率和游離膽固醇外流率與對(duì)照組相比分別增加了78.87％和110.96％。結(jié)果表明白

10、藜蘆醇能夠促進(jìn)經(jīng)apoAI途徑的泡沫細(xì)胞膽固醇外流，這一作用存在一定程度的時(shí)間——效應(yīng)關(guān)系。 加入apoAI組，當(dāng)白藜蘆醇作用時(shí)間為12h、24h和36h時(shí)，10μM、50μM和100μM白藜蘆醇均能夠提高巨噬泡沫細(xì)胞膽固醇(包括總膽固醇、游離膽固醇)的外流率，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，且在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，隨著白藜蘆醇濃度的增加，膽固醇的外流率隨之增加，在劑量為100μM時(shí)外流率達(dá)到最大，說(shuō)明白藜蘆醇促進(jìn)ap

11、oAI介導(dǎo)泡沫細(xì)胞膽固醇外流作用存在一定程度的劑量——效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)各劑量白藜蘆醇作用12h時(shí)，總膽固醇外流率和游離膽固醇外流率與對(duì)照組相比增加的百分比最高分別達(dá)到51.41％和43.61％；當(dāng)各劑量白藜蘆醇作用24h時(shí)，總膽固醇外流率和游離膽固醇外流率與對(duì)照組相比增加的百分比最高分別達(dá)到78.87％和110.96％；當(dāng)各劑量白藜蘆醇作用36h時(shí)，總膽固醇外流率和游離膽固醇外流率與對(duì)照組相比增加的百分比最高分別達(dá)到37.50％和43.21

12、％。 4.白藜蘆醇促進(jìn)小鼠腹腔巨噬泡沫細(xì)胞ABCA1和ABCG1的表達(dá)10μM、50μM和100μM白藜蘆醇培養(yǎng)巨噬泡沫細(xì)胞24h后，ABCA1mRNA的表達(dá)明顯增加，各劑量組與對(duì)照組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，且隨著白藜蘆醇濃度的增加，ABCA1mRNA的表達(dá)顯著增加，分別是對(duì)照組的5.24倍、14.92倍和63.65倍，存在明顯的劑量——效應(yīng)關(guān)系。 10μM、50μM和100μM白藜蘆醇培養(yǎng)巨噬泡沫細(xì)胞24

13、h后，ABCG1mRNA的表達(dá)明顯增加，各劑量組與對(duì)照組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，且隨著白藜蘆醇濃度的增加，ABCG1mRNA的表達(dá)顯著增加，分別是對(duì)照組的3.10倍、20.25倍和46.69倍，存在明顯的劑量——效應(yīng)關(guān)系。 5.放線菌素D阻斷白藜蘆醇誘導(dǎo)ABCA1和ABCG1表達(dá)5μg/mL放線菌素D與100μM白藜蘆醇共同培養(yǎng)巨噬泡沫細(xì)胞24h后，白藜蘆醇誘導(dǎo)ABCA1和ABCG1mRNA的表達(dá)明顯降低，與白藜蘆

14、醇組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.05)。 6.放線菌素D和ABCA1抑制劑阻斷白藜蘆醇誘導(dǎo)膽固醇的外流5μg/mL放線菌素D或400μMDIDS分別與100μM白藜蘆醇共同培養(yǎng)巨噬泡沫細(xì)胞24h后，白藜蘆醇誘導(dǎo)的巨噬泡沫細(xì)胞經(jīng)apoAI途徑膽固醇外流率降低，與白藜蘆醇組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。 7.白藜蘆醇促進(jìn)小鼠腹腔巨噬泡沫細(xì)胞LXRα的表達(dá)10μM、50μM和100μM白藜蘆醇培養(yǎng)巨噬泡沫細(xì)胞

15、24h后，LXRαmRNA的表達(dá)增加，各劑量組與對(duì)照組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，且隨著白藜蘆醇濃度的增加，LXRαmRNA的表達(dá)增加，分別是對(duì)照組的1.63倍、9.45倍和11.52倍，存在明顯的劑量——效應(yīng)關(guān)系。 8.LXRα抑制劑阻斷白藜蘆醇誘導(dǎo)ABCA1、ABCG1表達(dá)和膽固醇的外流10μMGGPP與100μM白藜蘆醇共同培養(yǎng)巨噬泡沫細(xì)胞24h后，白藜蘆醇誘導(dǎo)ABCA1和ABCG1mRNA的表達(dá)明顯降低，與白藜