豬偽狂犬病毒陜西省WG株的分離鑒定及其gD、gE基因的克隆與序列分析.pdf

1、偽狂犬病(Pseudorabies，PR)又名奧葉茲基氏病(Aujeszky'sDisease，AD)是由皰疹病毒科、α-皰疹病毒亞科中的偽狂犬病毒(PRV或ADV)引起的一種或多種動(dòng)物感染的急性傳染病，懷孕母豬主要表現(xiàn)為流產(chǎn)、死胎等繁殖障礙，仔豬表現(xiàn)為體溫升高、呼吸困難、神經(jīng)癥狀、流涎、生長停滯、體重下降及高死亡率，成年豬感染癥狀很輕微。豬是該病毒的主要宿主和傳染源，本病給養(yǎng)豬業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失僅次于豬瘟和口蹄疫。為了及時(shí)、準(zhǔn)確地掌握該

2、病在我省流行規(guī)律和特點(diǎn)，本研究開展了對(duì)陜西省PRV分離鑒定及其主要毒力因子gD、gE基因的克隆和序列分析等工作。 應(yīng)用檢測(cè)PRV野毒抗體的gE-ELISA方法，檢測(cè)了陜西省部分地區(qū)6個(gè)集約化豬場(chǎng)187份血清樣本，結(jié)果顯示野毒抗體平均陽性率為28.76％，其中野毒抗體最高為48.98％，最低為0；在這次調(diào)查中，PRV野毒在陜西省豬群中的感染普遍存在。從疑似PR的仔豬內(nèi)臟及腦組織中分離到的一株P(guān)RV,并進(jìn)行了生物學(xué)特性鑒定。用分離毒

3、感染雞胚可見到典型頭蓋骨隆起的病變，感染PK-15細(xì)胞后產(chǎn)生了典型的圓縮、集聚，脫落等細(xì)胞病變，連續(xù)傳代后，CPE出現(xiàn)的時(shí)間穩(wěn)定在20h左右。分離株病毒能被PRVMin-A株標(biāo)準(zhǔn)陽性血清中和，其在PK-15細(xì)胞上的TCID50為10-7.25/100μL。用感染病毒細(xì)胞的上清液接種家兔，出現(xiàn)典型的奇癢癥狀。以分離病毒的DNA為模板，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出gE基因612bp長的片段。以上鑒定結(jié)果表明從該豬場(chǎng)分離到的病毒是PRV，并命名為WG

4、株。 參考GenBank中已發(fā)表的PRV序列，針對(duì)gD、gE基因分別設(shè)計(jì)了2條特異性引物，提取病毒DNA，優(yōu)化PCR擴(kuò)增體系及程序，將鑒定的PRVWG株的gD、gE基因進(jìn)行擴(kuò)增，分別擴(kuò)出長為1203bp和1734bp的特異目的片斷；PCR產(chǎn)物純化回收后，與pMD18-T載體連接，再轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α細(xì)胞；經(jīng)Amp+的培養(yǎng)基培養(yǎng)并挑出單克隆菌落；培養(yǎng)后用試劑盒提取質(zhì)粒，并對(duì)其進(jìn)行酶切和PCR鑒定，篩選陽性克隆的重組質(zhì)粒進(jìn)行

5、測(cè)序。利用DNAstar軟件將測(cè)序結(jié)果同國內(nèi)外已發(fā)表序列進(jìn)行同源性比較并繪制基因進(jìn)化樹，推測(cè)分離株與參考毒株之間的遺傳距離。結(jié)果表明，所有PRV毒株之間核苷酸序列同源性均很高，WG株gD基因與已公開發(fā)表的PRV-Min-A株、PRV-Ea株、PRV-LA株、PRV-Fa株、SA215、Korea株及美國(BK001744)株的核苷酸同源性在98.7％～99.5％之間，氨基酸推導(dǎo)序列的同源性均在96.8％～98.8％之間；PRV-WG株g