人用狂犬病毒核蛋白、糖蛋白定量檢測試劑的研制及應(yīng)用.pdf

1、研究背景及目的:狂犬病病毒（RV）屬于彈狀病毒科，狂犬病病毒屬，形態(tài)呈子彈狀，長180 nm，直徑75 nm，其頭部為半球形，末端常為平端，病毒顆粒由外殼和核心兩部分組成。其基因組由11928～11932個(gè)核苷酸組成，為單鏈、不分節(jié)段的負(fù)鏈RNA，含5個(gè)大的開放閱讀框，編碼5種結(jié)構(gòu)蛋自?；蚪M從3'端至5'端的排列順序?yàn)镹、P、M、G和L基因，分別編碼病毒核蛋白(NP)、磷蛋白(NS)、膜基質(zhì)蛋白(MP)、糖蛋白(GP)和轉(zhuǎn)錄大蛋白(L

2、P)。
　　 近年來的研究表明，狂犬病毒疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的免疫應(yīng)答反應(yīng)主要與核蛋白和糖蛋白有關(guān)。
　　 核蛋白在病毒顆粒中數(shù)量眾多，占病毒蛋白總量的36％。核蛋白基因序列相對恒定，點(diǎn)突變較少，不同株系的同源性在98％～99.6％，是病毒中最穩(wěn)定的蛋白，可用作檢測抗原，也是狂犬病病毒基因分型的主要依據(jù)。核蛋白能誘導(dǎo)保護(hù)性免疫。它是一種能誘導(dǎo)對不同型狂犬病病毒產(chǎn)生交叉保護(hù)的T輔助細(xì)胞(Th)抗原，蛋白的21～35區(qū)域

3、、394～408區(qū)域、404～418區(qū)域是主要的Th細(xì)胞表位。狂犬疫苗接種后，人外周血分離到的狂犬特異性的反應(yīng)T細(xì)胞要比其它疫苗接種后分離到的特異性T細(xì)胞數(shù)量多，在這些特異性反應(yīng)T細(xì)胞中，多數(shù)是Th細(xì)胞，它們絕大多數(shù)表現(xiàn)對核蛋白特異性反應(yīng)，提示核蛋白是誘導(dǎo)狂犬病細(xì)胞免疫的主要成分。此外，核蛋白還能促進(jìn)中和抗體的產(chǎn)生。把NP加福氏完全佐劑初免小鼠后，用滅活狂犬病毒加強(qiáng)，中和抗體水平明顯上升，而用GP加強(qiáng)，中和抗體產(chǎn)生不明顯。NP抗體還能抑

4、制狂犬病毒在細(xì)胞間的傳播和在細(xì)胞內(nèi)的繁殖。因此，核蛋白是狂犬病毒疫苗組分中不可缺少的成分之一，是評價(jià)疫苗活力的一個(gè)重要指標(biāo)。
　　 GP是狂犬病毒中唯一能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的抗原，其抗原性的保持主要依賴于其空間構(gòu)象?？袢《綠P的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與其抗原性和免疫原性密切相關(guān)，它在刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的過程中發(fā)揮重要作用。GP是狂犬病毒的主要保護(hù)性抗原。具有B、T細(xì)胞識別位點(diǎn)，能夠誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，刺激機(jī)體分泌中和抗體。因

5、此，糖蛋白羧基末端是否缺失及其主要抗原位點(diǎn)空間構(gòu)象是否被破壞或缺失是衡量狂犬疫苗抗原活力好壞的另一個(gè)關(guān)鍵性指標(biāo)。
　　 狂犬病毒核蛋白、糖蛋白含量是狂犬病疫苗的主要質(zhì)量指標(biāo)，在精制狂犬病疫苗的研制過程中常需要及時(shí)進(jìn)行抗原含量的檢測，多年來一直用NIH動物法測定。該方法測定周期長，操作繁瑣，以及國際動物保護(hù)協(xié)會對實(shí)驗(yàn)動物使用的制約，不適用于提純過程中各步驟的監(jiān)測。因此，尋求可靠的體外檢測狂犬病毒疫苗效力的實(shí)驗(yàn)方法來替代NIH法勢在

6、必行。
　　 本研究采用時(shí)間分辨免疫熒光分析（TRFIA）技術(shù)研制人用狂犬病毒N蛋白、G蛋白定量檢測試劑，評價(jià)各項(xiàng)性能指標(biāo)，并與其它檢測試劑盒進(jìn)行比較，評價(jià)其在臨床檢測應(yīng)用中的可行性。時(shí)間分辨免疫熒光分析(TRFIA)是以稀土離子標(biāo)記抗原或抗體、核酸探針和細(xì)胞等為特征的新型的非放射性免疫標(biāo)記技術(shù)，它克服了ELISA酶標(biāo)記物的不穩(wěn)定、O.D值僅在低濃度范圍與酶活性呈線性關(guān)系，Hook效應(yīng)嚴(yán)重、酶的活性容易失活，靈敏度不高等缺點(diǎn)，使

7、非特異性信號降低到可以忽略的程度，達(dá)到極高的信噪比，從而大大地超過了放射性同位素所能達(dá)到的靈敏度，且還具有標(biāo)記物制備簡便、儲存時(shí)間長、無放射性污染、檢測重復(fù)性好、操作流程短、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬、不受樣品自然熒光干擾和應(yīng)用范圍十分廣泛等優(yōu)點(diǎn)，成為繼放射免疫分析之后標(biāo)記物發(fā)展的一個(gè)新里程碑，已成為生物醫(yī)學(xué)研究和臨床超微量生化檢驗(yàn)中一項(xiàng)最有發(fā)展前景的分析手段，有望未來實(shí)現(xiàn)代替NIH法為檢測狂犬疫苗效力。
　　 方法:采用雙抗體夾心法研制人

8、用狂犬病毒核蛋白定量檢測試劑，評價(jià)各項(xiàng)性能指標(biāo);采用雜交瘤融合法制備狂犬病毒糖蛋白單克隆抗體。
　　 1.人用狂犬病毒N蛋白定量檢測試劑的研制與應(yīng)用
　　 1.1狂犬病毒N蛋白抗原的制備:根據(jù)狂犬病病毒CTN株N基因序列設(shè)計(jì)引物，提取狂犬病毒CTN株疫苗總RNA，采用AMV酶逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，利用PCR的方法從cDNA中擴(kuò)增N基因，將該基因片段定向克隆到原核表達(dá)載體p ET32a(+)中，構(gòu)建原核表達(dá)載體p ET32a

9、/N。陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原核表達(dá)宿主菌BL21(DE3)，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)并確定表達(dá)N基因的最佳誘導(dǎo)時(shí)間。SDS-PAGE和Western-blot對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行檢測和分析。
　　 1.2人用狂犬病毒抗N蛋白單克隆抗體的制備:以狂犬病毒全蛋白為抗原免疫Bal/C小鼠，效價(jià)達(dá)到1∶64000后，采用雜交瘤融合的方法制備單克隆抗體，再NP抗原對抗體進(jìn)行篩選，篩出14株抗NP單抗。
　　 1.3人用狂犬病毒抗N蛋白單克隆抗體的

10、純化:用Protein G Sepharose4 Fastflow親和層析柱純化，并用BCA試劑盒測抗體濃度。
　　 1.4銪標(biāo)記抗體與純化:將抗N蛋白抗體分別取0.5 mg加入50 KD的蛋白超濾離心柱中，9000 r/min離心8 min。再用標(biāo)記緩沖液(50 mmol/L，Na2CO3，pH9.0)重復(fù)洗滌6次。將200μl標(biāo)記抗體和50μg銪標(biāo)記試劑充分混勻，25℃振蕩過夜。標(biāo)記完成后加入蛋白超濾離心柱中，9000 r/

11、min離心8min。再用洗脫液(含0.9％ NaCl的50 mmol/L Tris-HCl)重復(fù)洗脫6次，棄濾液，最后再加入500μl洗脫液，靜置2min后，倒扣9000 r/min離心5 min，收集濾液。
　　 1.5單抗配對篩選:先用狂犬病毒原液作為雙抗夾心的標(biāo)準(zhǔn)品，將14株抗NP單抗一一包被，與另外13株銪標(biāo)配對，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，篩出配對得上的單抗，再用自制NP和企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品作為標(biāo)準(zhǔn)品，從中繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終篩出配對得上的單

12、抗。
　　 1.6試劑盒性能指標(biāo)考核:準(zhǔn)確性測試（稀釋回收率）、線性范圍的檢測、靈敏度（最低檢測量）、精密度測試、穩(wěn)定性測試、自制試劑與其他試劑比較。
　　 1.6.1準(zhǔn)確性測試（稀釋回收率）:將樣品1、樣品2、樣品3分別按1∶200，1∶400，1∶800和1∶1600倍比稀釋，每次試驗(yàn)作3復(fù)孔，重復(fù)測定3次，n=3×3，計(jì)算其測定值、真實(shí)值、標(biāo)準(zhǔn)差和回收率。
　　 1.6.2線性范圍的檢測:將參考標(biāo)準(zhǔn)品抗原稀

13、釋成不同濃度進(jìn)行測定。每一濃度測試值作3復(fù)孔，測試3次，n=3×3，計(jì)算試驗(yàn)的測定值、真值及其比值，分析線性回歸并計(jì)算試驗(yàn)的相關(guān)系數(shù)r。
　　 1.6.3靈敏度（最低檢測量）:以標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液作為空白零點(diǎn)(A)當(dāng)作樣品測量，每次試驗(yàn)設(shè)8復(fù)孔，重復(fù)3次，n=8×3，計(jì)算其均值及標(biāo)準(zhǔn)差。
　　 1.6.4精密度測試:分析內(nèi)精密度:將企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品A-F點(diǎn)各做10個(gè)復(fù)孔，計(jì)算其均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差及CV值;分析間精密度:將企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品A-F點(diǎn)

14、由3個(gè)不同的技術(shù)員來操作，分別各做10個(gè)復(fù)孔，計(jì)算其均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差及CV值。
　　 1.6.5穩(wěn)定性測試:將自制試劑盒分別置于4℃冰箱半年和37℃7天，對各條件下試劑盒的物理外觀、劑量-反應(yīng)曲線的線性、準(zhǔn)確性、精密度、最低檢出量、特異性等指標(biāo)進(jìn)行測定。
　　 1.6.6與武漢研究所狂犬病毒N蛋白ELISA試劑盒測值比較:將自制試劑盒與武漢所ELISA狂犬病毒檢測試劑盒同時(shí)進(jìn)行樣品測定，并計(jì)算其相關(guān)系數(shù)。
　　 2.

15、人用狂犬病毒G蛋白單克隆抗體的制備:以人用狂犬病毒疫苗免疫Bal/C小鼠，效價(jià)達(dá)到1∶64000后，采用雜交瘤融合的方法制備單克隆抗體，用狂犬病毒原液和GP篩選陽性株，再用實(shí)驗(yàn)室自制NP、人白蛋白對抗體進(jìn)行反篩，篩出48株抗GP單抗。
　　 結(jié)果:成功的將狂犬病毒N蛋白基因克隆到p ET32a(+)原核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)PCR、限制性酶切和測序等鑒定，成功構(gòu)建了p ET32a/N重組原核表達(dá)質(zhì)粒。重組質(zhì)粒pET32a/N在大腸桿菌中表

16、達(dá)出狂犬病毒N蛋白的融合蛋白，分子量約為70kDa，與理論值基本符合，表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在。重組蛋白經(jīng)過包涵體洗滌Ni親和層析純化后，純度均達(dá)90％以上。用抗His標(biāo)簽抗體對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western-blot分析，發(fā)現(xiàn)特異性條帶出現(xiàn)在70 kDa處，表明該蛋白確實(shí)是所要表達(dá)融合蛋白。用純化的狂犬病毒免疫小鼠，三次免疫后效價(jià)達(dá)到1∶64000，細(xì)胞融合制備得14株抗NP單克隆抗體，ELISA酶免結(jié)果顯示:自制單克隆抗體能與天然

17、蛋白能發(fā)生特異性反應(yīng)，說明制備的單抗均為特異性單抗。用時(shí)間分辨的方法篩選得到FO23和F022一對配對抗體，并用這對抗體制備狂犬病毒N蛋白試劑盒。NP試劑盒準(zhǔn)確度好，線性范圍為5～2500 mEU/ml，靈敏度為1.018mEU/ml，精密度良好，分析內(nèi)精密度為2.7％～9.3％，分析間精密度為3.5％～12.2％。穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，試劑可以在4℃穩(wěn)定半年，37℃穩(wěn)定7天。與武漢研究所狂犬病毒N蛋白ELISA試劑盒測值比較，本試劑盒檢測所

18、得結(jié)果與武漢所N蛋白試劑盒趨于高度一致。用狂犬病毒疫苗免疫Bal/C小鼠，效價(jià)達(dá)到1∶64000后，采用雜交瘤融合的方法制備單克隆抗體，用狂犬病毒原液和GP篩選陽性株，再用實(shí)驗(yàn)室自制NP、人白蛋白對抗體進(jìn)行反篩，篩出48株抗GP單抗，ELISA酶免結(jié)果顯示:自制單克隆抗體能與天然蛋白能發(fā)生特異性反應(yīng)，說明制備的單抗均為特異性單抗。
　　 結(jié)論:以上結(jié)果表明，本研究成功地構(gòu)建了p ET32a/N原核重組表達(dá)質(zhì)粒，并在大腸桿菌中大量