生長因子在肌腱損傷愈合早期中的表達變化及轉基因治療肌腱損傷的初步研究.pdf

1、目的： (1)檢測結締組織生長因子(CTGF)、轉化生長因子β(TGF-β)、類胰島素生長因子1(IGF-1)、血管內皮生長因子(VEGF)、血小板源性生長因子(PDGF-B)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)在肌腱損傷愈合早期的mRNA水平變化規(guī)律和TGF-β，bFGF和IGF-1在蛋白水平的表達變化。 (2)探索微量注射法以不同轉基因載體轉基因至損傷肌腱的轉基因效率、分布和組織反應。 (3)比較腺病毒(Ad

2、)、腺相關病毒(AAV)和脂質體-質粒(liposome-plasmid)三種轉基因載體在肌腱中的基因轉染效率并觀測腺相關病毒載體介導堿性成纖維細因子(bFGF)基因在肌腱愈合過程中表達。 (4)探討微小RNA導入肌腱細胞和損傷肌腱沉默轉化生長因子(TGFβ)基因的作用及對I型膠原、III型膠原和CTGF基因表達的影響。 方法： (1)在雞趾的掌面掌趾關節(jié)與近節(jié)趾間關節(jié)間行Bruner切口，游離出趾深屈肌腱(FD

3、P)，并在趾半屈曲位時用銳刀將其從掌側橫形做完全切斷，然后用5-0無創(chuàng)縫線做改良Kessler法縫合修復肌腱。在術后第3、5、7、9、14和21天分別取肌腱，做TGF-β，bFGF和IGF-1免疫組化染色，觀測其表達變化和分布。通過實時PCR方法檢測CTGF、TGF-β、VEGF、IGF-1、PDGF-B和bFGF基因的mRNA水平在術后第3、9、14和21天四個時間點表達變化。 (2)用微量注射器將10微升攜帶增強綠色熒光蛋白

4、(EGFP)報告基因的pCMV-EGFP、pCAGGS-EGFP、AAV2-EGFP和Ad5-EGFP載體直接注射入18只雞的48根橫斷傷的趾屈肌腱近側斷端截面上取兩點注射。在術后第3、7、14、21天分別取肌腱，進行冰凍切片后在熒光顯微鏡下觀察肌腱內的EGFP表達量及分布，并將肌腱切片作HE染色后觀察各不同載體在肌腱中引起的炎癥反應。另24根肌腱不作手術作為對照。 (3)用微量注射器將攜帶增強綠色熒光蛋白報告基因的pCMV-E

5、GFP、AAV2-EGFP和Ad5-EGFP注射入雞的正常趾深屈肌腱中，術后第3、7、14和21天分別取肌腱進行冰凍切片，熒光顯微鏡觀測肌腱內EGFP的表達。將攜帶有bFGF基因的AAV2-bFGF病毒顆粒注入完全切斷的雞的趾深屈肌腱，術后的第2、3和4周獲取注射AAV2-bFGF實驗組的肌腱及對照組肌腱做免疫組化染色。 (4)針對雞TGFβ1基因的mRNA序列，設計并合成4對miRNA TGFβ1 DNA序列和一對不編碼序列，

6、分別插入至miRNA質粒載體(pcDNA6．2)中，獲得5個miRNA TGFβ1質粒載體，其分別命名為miRNA＃1、＃2、＃3、＃4和陰性對照。將不同的miRNA載體轉染培養(yǎng)的肌腱細胞，用熒光顯微鏡觀測載體攜帶的增強綠色熒光蛋白報告基因在肌腱細胞的表達，并使用流式細胞儀評價轉基因的效率。采用實時PCR技術檢測并分析miRNA導入肌腱細胞后TGFβ1、I、III型膠原和CTGF基因表達變化。選用抑制TGFβ1表達最明顯的miRNA＃1

7、載體轉染活體損傷肌腱。在轉基因治療肌腱一周和六周后，檢測TGF-β1、I、III型膠原和CTGF基因在體內損傷肌腱中的表達。 結果： (1)在肌腱損傷愈合早期CTGF、TGF-β基因mRNA表達水平較高，其中TGF-βmRNA在肌腱損傷后呈增高的趨勢；VEGF和IGF-1基因mRNA表達水平次之；bFGF和PDGF-B基因mRNA在肌腱損傷后表達水平較低，且bFGF基因mRNA呈逐漸下降的趨勢。TGF-β，bFGF和IG

8、F-1免疫組化也顯示相同結果。 (2)熒光顯微鏡下觀測發(fā)現，注射4種轉基因載體的肌腱，轉染3天后即可見肌腱內有增強綠色熒光蛋白表達；在第7天時表達最明顯；第14天時，各組表達增強綠色熒光蛋白表達量下降；21天時很少有表達增強綠色熒光蛋白的細胞。用微量注射器在腱段兩點注射能保證近損傷肌腱內轉染細胞均勻分布。注射AAV2-EGFP和Ad5-EGFP的肌腱的增強綠色熒光蛋白明顯多于質粒載體的增強綠色熒光蛋白，而AAV2-EGFP和Ad

9、5-EGFP兩組間無明顯差異。HE染色發(fā)現質粒載體和Ad5-EGFP致肌腱的組織反應較重，可見較多炎癥細胞浸潤，以淋巴細胞和中性粒細胞為主。注射AAV2-EGFP的肌腱炎癥反應較輕。 (3)熒光顯微鏡下可見三種不同的載體在肌腱內均表達EGFP：轉染3天后即可見肌腱內有EGFP表達；在第7天時表達最明顯；第14天時，各組EGFP的表達下降；21天時很少有表達EGFP細胞。在同期的時間點，注射AAV2-EGFP和Ad5-EGFP的肌

10、腱內EGFP表達明顯強于質粒載體，而AAV2-EGFP和Ad5-EGFP兩組之間無較大區(qū)別。術后的第2、3和4周免疫組化染色結果發(fā)現：相比于正常和對照組肌腱，注射AAV2-bFGF的肌腱表達很強的bFGF。 (4)體外細胞培養(yǎng)中熒光顯微鏡觀察到肌腱細胞有EGFP表達，流式細胞儀檢測基因轉染效率為20～25％。與陰性對照細胞組相比，實時PCR結果分析顯示：miRNA＃1和＃2質粒載體治療的細胞組TGFβ1基因表達分別下降了68％和

11、43％；在miRNA＃1治療的細胞組，III型膠原和CTGF基因表達分別也下降70％和68％，這些變化在統(tǒng)計學上有顯著性。使用miRNA＃1干擾質粒轉基因至體內損傷肌腱結果顯示：術后一周，TGFβ1基因表達下降了67％，而I、III型膠原和CTGF基因表達沒有變化；術后六周，TGFβ1和III型膠原基因表達分別下降了56％和58％，變化在統(tǒng)計學上有顯著性。 結論： (1)在肌腱損傷愈合的早期(3周內)TGF-β基因表達水

12、平較高，呈逐漸升高趨勢；CTGF，VEGF，and IGF-1表達次之；bFGF基因表達水平較低且逐漸降低；PDGF-B表達較低。 (2)用微量注射器在腱段兩點注射轉基因載體能轉染近損傷處的整個肌腱段的細胞。在研究的四種基因治療方法中，AAV2和Ad5在在損傷肌腱中的轉基因效率最強，在轉基因后第7天表達最明顯，而且AAV2引起的肌腱組織反應最輕。提示AAV2載體比Ad5和質粒載體有利于作為轉基因治療肌腱損傷的載體，微量注射載體是

13、轉基因至損傷肌腱的合適方法。 (3)Ad5和AAV2載體的基因轉染效率高于脂質體-質粒載體，AAV2攜帶的外源性bFGF基因肌腱細胞內較強表達，提示我們將來在體內轉基因到肌腱的研究中能夠選擇腺病毒和腺相關病毒載體作為運載基因的工具。 (4)miRNA導入肌腱細胞后TGFβ1、III型膠原和CTGF基因表達顯著下降。導入miRNA至活體損傷肌腱后一周，TGFβ1基因表達顯著下降；術后六周，TGFβ1和III型膠原基因表達顯