衣原體分泌糖脂對iNKT細胞的激活作用及Il-22在衣原體感染中的作用研究.pdf

1、第一部分沙眼衣原體分泌性糖脂(GLXA)對iNKT細胞激活作用的研究
　　 研究目的：
　　 衣原體（Chlamydiae）是一類專性細胞內寄生，有獨特發(fā)育周期的原核細胞型微生物，衣原體感染與許多人類疾病有著密切聯(lián)系。根據基因型的不同，衣原體可分為沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis，Ct)和肺炎衣原體（Chlamydiapneumoniae，Cpn）兩個種屬。其中沙眼衣原體主要引起呼吸道感染、眼部粘膜感

2、染及性傳播疾病。最近，沙眼衣原體中的鼠類變種株被單獨劃分出來，被命名為衣原體鼠肺炎株（Chlamydiamuridarum，Cm），該株廣泛用于建立小鼠肺部或生殖道感染模型，進行沙眼衣原體致病機制的理論研究。而肺炎衣原體主要引起支氣管炎、鼻竇炎、肺炎等呼吸道疾病。雖然抗生素可有效控制衣原體的感染癥狀，但是衣原體感染的臨床表現(xiàn)具有多樣性，大多數以隱性感染的形式存在，被感染者不能及時就診，使得抗生素對感染的控制力大大減弱，因此，研發(fā)安全有效

3、的疫苗對控制衣原體感染意義重大，目前尚無有效的疫苗預防和（或）治療衣原體感染。闡明衣原體感染過程中免疫保護和免疫病理的機制是合理研制安全有效衣原體疫苗的首要條件。
　　 自然殺傷性T細胞（invariantnaturalkillerTcell，iNKT）作為獨特的T細胞亞群識別由非經典的MHCI類分子CD1d遞呈的糖脂類抗原，而不是肽類抗原。研究表明，在衣原體感染中iNKT細胞被激活并產生細胞因子，通過其對獲得性免疫應答的調節(jié)在

4、衣原體感染的進程和轉歸中發(fā)揮重要作用。衣原體分泌性糖脂抗原(glycolipidexoantigen，GLXA)是目前已被報道的一種和衣原體感染相關的糖脂抗原，但GLXA能否活化NKT細胞，以及它是否是衣原體感染中對iNKT細胞作用的關鍵抗原尚不清楚。因此，本研究擬證實GLXA能否在體內外激活iNKT細胞，進一步明確衣原體感染的免疫機制，為以GLXA為靶點的衣原體疫苗的研制奠定理論基礎。
　　 研究方法：
　　 提取衣原

5、體培養(yǎng)上清中的分泌性糖脂，并以相同的方法提取未感染細胞培養(yǎng)上清中的脂類(cellmock)作為實驗對照，對糖脂成分進行銀染顯色和WesternBlot鑒定分析。為驗證該糖脂是否能夠激活iNKT細胞，采用了體外實驗和體內試驗分別進行驗證:
　　 1.體外實驗:
　　 1)CD1d蛋白+NKT雜交瘤共培養(yǎng)系統(tǒng):用CD1d融合蛋白包被96孔細胞培養(yǎng)板，然后在板中加入GLXA和NKT雜交瘤進行共培養(yǎng)，ELISA檢測培養(yǎng)上清中IL

6、-2的水平，以明確GLXA能否活化NKT雜交瘤細胞。
　　 2)體外共培養(yǎng)系統(tǒng):制備小鼠骨髓來源的樹突狀細胞(DC)，經糖脂沖擊樹突狀細胞24小時后，與肝臟單個核細胞(LMC)共培養(yǎng)，48小時后收集培養(yǎng)上清ELISA法檢測細胞因子IFN-γ和IL-4。并在共培養(yǎng)實驗中采用iNKT缺陷小鼠以及CD1d抗體封閉系統(tǒng)進一步驗證作用機制。
　　 2.體內試驗:
　　 1)靜脈注射:采用C57BL/6(WT)小鼠和iNKT

7、缺陷小鼠，分別經尾靜脈注射給予GLXA，注射后2h對小鼠取血，用ELISA檢測血清中IL-4的表達水平，注射后12h取血，用ELISA檢測血清中IFN-γ的表達水平。
　　 2)腹腔注射:小鼠腹腔注射GLXA，用流式細胞術分析其對iNKT表面活化標志及細胞因子分泌的影響。
　　 研究結果：
　　 1.糖脂鑒定:銀染顯色和WesternBlot分析顯示，提取的衣原體分泌性糖脂與文獻報道的GLXA條帶一致，與cell

8、mock實驗對照組形成的條帶明顯不同。
　　 2.體外實驗:
　　 1)CD1d蛋白+NKT雜交瘤共培養(yǎng)系統(tǒng):與對照組相比，GLXA可特異性活化NKT雜交瘤細胞，使其產生IL-2。
　　 2)體外共培養(yǎng)系統(tǒng):GLXA沖擊組產生的IFN-γ和IL-4均高于cellmock沖擊組及陰性對照組（DC未經抗原刺激），表明分泌性糖脂能夠激活LMC產生細胞因子。為進一步驗證LMC產生的IFN-γ和IL-4主要來源于iNKT細

9、胞，在DC-LMC共培養(yǎng)實驗中采用了iNKT缺陷小鼠以及CD1d抗體封閉，結果顯示:(1)來源于iNKT缺陷小鼠LMC產生的IFN-γ和IL-4均顯著低于野生型小鼠.(2)加入CD1d抗體封閉后，野生型小鼠LMC產生IFN-γ和IL-4也明顯下降。由此證明衣原體分泌性糖脂誘導的細胞因子主要由iNKT細胞產生，而且此作用部分依賴于CD1d分子。
　　 3.體內試驗:
　　 1)靜脈注射:在給予GLXA刺激的野生型小鼠血清中

10、，可檢測出較高水平的IFN-γ和IL-4，在iNKT缺陷小鼠中卻沒有發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象，說明血清中較高水平的IFN-γ和IL-4主要是由iNKT細胞產生的，而且是GLXA促進iNKT細胞產生的細胞因子。
　　 2)腹腔注射:通過流式細胞術檢測，與對照組相比GLXA可明顯提高iNKT細胞表面活化標志的表達，并促進其分泌細胞因子IFN-γ和IL-4，說明其對iNKT細胞有明顯的激活作用。
　　 研究結論：
　　 以上實驗證

11、明，衣原體分泌性糖脂GLXA能夠激活iNKT細胞并產生細胞因子，并且該活化作用在一定程度上依賴CD1d分子的遞呈作用，GLXA可能是衣原體感染中iNKT細胞活化的關鍵抗原，有關GLXA激活iNKT細胞的作用機制尚需進一步研究。
　　 研究意義：
　　 該研究進一步完善了我們對衣原體致病機制的認識，加深了衣原體感染引起的宿主免疫反應機制的了解，為以GLXA為靶點設計疫苗抵抗衣原體感染奠定了實驗和理論基礎。
　　 第

12、二部分、白細胞介素-22在衣原體肺部感染中的生物學作用
　　 研究目的：
　　 白細胞介素-22(IL-22)是IL-10細胞因子家族的一員，它是一種炎癥因子，在調控組織局部免疫方面起著重要的作用。近期的研究證實，IL-22在抵抗細菌、真菌、病毒和寄生蟲感染所引發(fā)的宿主免疫中起到一定保護作用。目前普遍接受的觀點是IL-22在枸櫞酸桿菌、克雷伯桿菌、分節(jié)絲狀桿菌等胞外菌引起的感染中起到保護作用，但是IL-22在宿主抵抗胞內

13、菌感染中的作用目前仍不明確。因此進一步在胞內菌感染模型中評估IL-22的作用是十分必要的，這有利于明確IL-22在胞內菌感染中的生物學效應，并為其提供更充分的理論學依據。
　　 衣原體是專性胞內寄生菌，其中對人類致病的種屬是沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis，Ct)和肺炎衣原體（Chlamydiapneumonia，Cpn）。沙眼衣原體主要引起呼吸道、眼睛及性疾病的傳播。肺炎衣原體主要引起支氣管炎、鼻竇炎和肺炎

14、。由于衣原體菌株具有一定的種屬特異性，近些年引起小鼠肺炎的菌株被單獨劃分出來稱為鼠肺炎衣原體（Chlamydiamuridarum，Cm）。目前在實驗研究中，鼠肺炎衣原體株被廣泛用于小鼠呼吸道和生殖道感染模型中。在小鼠呼吸道感染模型中，目前的研究證實Th1型細胞免疫反應起到主要的保護作用，可有效控制衣原體感染，對疾病的轉歸起到決定性作用。我們前期的實驗結果證實Th17在宿主防御衣原體感染中也起到重要的作用，它可以促進Th1型細胞免疫反應

15、。因此，Th1和Th17細胞免疫反應對于宿主清除病原菌起到重要的促進作用。IL-22和IL-17是Th17細胞亞群主要產生的細胞因子，它們在許多感染模型中都起到相互協(xié)同的作用。迄今為止，沒有實驗研究證實IL-22在小鼠肺部衣原體感染中的作用。在本研究中，我們擬用抗小鼠IL-22單克隆抗體封閉小鼠體內固有產生的IL-22，從而進一步評估IL-22在小鼠肺部衣原體感染中的作用。
　　 研究方法：
　　 1、IL-22抗體封閉

16、實驗:在小鼠Cm肺感染模型中，用小鼠IL-22單克隆抗體對肺局部的IL-22進行封閉，以檢測IL-22的作用。
　　 1)流式細胞術:檢測Th1、Th17、Treg等細胞亞群的變化情況。
　　 2)ELISA:檢測細胞培養(yǎng)上清中IL-6、IL-10、IL-12p40、IL-17、IFN-γ等細胞因子的表達水平。
　　 3)RT-PCR:檢測IL-22、IL-17、IFN-γ、T-bet、RORγt在RNA水平上的

17、變化情況。
　　 4)HE染色:肺組織切片鏡檢。
　　 2、IL-22蛋白給予實驗:在小鼠Cm肺感染模型中，肺局部給予小鼠純化IL-22蛋白，以檢測IL-22對疾病轉歸的影響。
　　 1)流式細胞術:檢測Th1、Th17等細胞亞群的變化情況。
　　 2)ELISA:檢測培養(yǎng)上清中IL-17、IFN-γ等細胞因子的表達水平。
　　 3)HE染色:肺組織切片鏡檢。
　　 研究結果：
　　

18、 1、IL-22抗體封閉實驗:IL-22在小鼠Cm肺部感染的早期階段就有升高表達，用抗體將其封閉后結果如下:與同型對照組相比，IL-22抗體封閉組的肺部炎癥更加嚴重，表現(xiàn)為體重下降更明顯，負菌量升高，病理組織切片炎癥浸潤更加明顯。流式分析顯示IL-22抗體封閉組的Th1細胞和Th17細胞免疫反應降低，而CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞群增高，此外IL-10的生成也隨著IL-22的封閉而減少。
　　 2、IL-22蛋白

19、給予實驗:將IL-22純化蛋白給予Cm肺部感染的小鼠后，很好地控制了肺部炎癥的發(fā)展和衣原體的增殖，并促進了肺部的Th17細胞免疫反應。
　　 研究結論：
　　 IL-22產生并高表達于小鼠Cm肺部感染的早期階段，可以保護機體減輕衣原體的肺部感染。IL-22這種保護性作用主要是通過促進Th17細胞免疫反應實現(xiàn)的。
　　 研究意義
　　 IL-22作為一種重要的炎癥因子參與了機體防御衣原體肺部感染的進程，它對