歸肝經(jīng)中藥對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖抑制及凋亡誘導(dǎo)作用研究.pdf

1、肝癌在我國(guó)癌癥發(fā)病率中居第二位，目前對(duì)中、晚期及復(fù)發(fā)性肝癌尚無(wú)特效治療藥物。中醫(yī)藥綜合治療因能改善患者臨床癥狀，延長(zhǎng)生存期，改善生活質(zhì)量而倍受關(guān)注。近年來(lái)中醫(yī)藥抗肝癌研究取得一定成績(jī)，但其機(jī)制仍未完全明晰。因此，探索中醫(yī)藥抗肝癌機(jī)制,對(duì)臨床肝癌的治療，以及篩選高效、低毒的抗肝癌中藥有效成分均具有重要的意義。
　　 目的：觀察歸肝經(jīng)中藥對(duì)體外HepG2細(xì)胞增殖及凋亡的影響，初步探討歸肝經(jīng)中藥抗肝癌作用的趨向性。
　　 方法

2、：
　　 1. 歸肝經(jīng)中藥選取莪術(shù)、水蛭、丹參；非歸肝經(jīng)中藥選取白花蛇舌草為對(duì)照。采用揮發(fā)油法提取莪術(shù)油，水提醇沉法制備丹參、白花蛇舌草提取物；采用水提醇沉法及液氮快速凍融法提取水蛭提取物。高效液相色譜法鑒定丹參、白花蛇舌草提取物含量，揮發(fā)油含量測(cè)定莪術(shù)油，并對(duì)比水蛭提取物的兩種制備方法。
　　 2.采用MTT法檢測(cè)歸肝經(jīng)中藥莪術(shù)、水蛭、丹參提取物對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用，以非歸肝經(jīng)中藥白花蛇舌草提取物、空白組為對(duì)

3、照，根據(jù)直線回歸方程計(jì)算達(dá)到半數(shù)抑制率（IC50）所對(duì)應(yīng)的提取物藥物濃度與生藥量，并以IC50對(duì)應(yīng)的提取物藥物濃度作為下一步實(shí)驗(yàn)的工作濃度。
　　 3.采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)、吖啶橙熒光染色并分析比較歸肝經(jīng)中藥莪術(shù)、水蛭、丹參提取物與非歸肝經(jīng)中藥白花蛇舌草提取物在IC50藥物濃度下對(duì)HepG2 細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及誘導(dǎo)凋亡的差異性。
　　 結(jié)果：
　　 1.丹參、白花蛇舌草水提醇沉法提取物的高效液相色譜法鑒定

4、含量分別為丹參酮IIA 0.403mg/g，熊果酸0.212％，揮發(fā)油含量測(cè)定莪術(shù)中莪術(shù)醇、莪術(shù)酮含量分別為11.70％、5.20％，均符合制備標(biāo)準(zhǔn)。水蛭兩種方法制備后經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)，液氮快速凍融法提取的成分含量要顯著高于水提醇沉法。
　　 2.MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示：莪術(shù)油IC50藥物濃度值為4.992μg/mL，相當(dāng)于生藥1.543mg/mL ； 水蛭提取物IC50 藥物濃度值為4.0018mg/mL，相當(dāng)于生藥15.69

5、mg/mL; 丹參提取物的IC5 0藥物濃度值為8.007mg/mL，相當(dāng)于生藥22.81mg/mL；白花蛇舌草提取物的IC50藥物濃度值為25.04mg/mL，相當(dāng)于生藥259.75mg/mL。白花蛇舌草提取物IC50藥物濃度所對(duì)應(yīng)生藥量是丹參提取物的11.39 倍，水蛭提取物的16.56 倍，莪術(shù)油的168.38 倍。
　　 3．IC50藥物濃度作用下HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果顯示：24h時(shí)，莪術(shù)提取物處理后細(xì)胞數(shù)減少，其他

6、中藥提取物生長(zhǎng)抑制作用不明顯；48h、72h時(shí)，歸肝經(jīng)中藥莪術(shù)、水蛭、丹參提取物抑制HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)作用強(qiáng)于非歸肝經(jīng)中藥白花蛇舌草提取物，三種提取物之間作用無(wú)明顯差異。
　　 4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：IC50藥物濃度處理24h時(shí)，莪術(shù)、丹參提取物誘導(dǎo)凋亡作用強(qiáng)于白花蛇舌草、水蛭提取物；處理48h、72h時(shí)，歸肝經(jīng)中藥莪術(shù)、水蛭、丹參提取物誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞凋亡率高于非歸肝經(jīng)中藥白花蛇舌草提取物，其中48h莪術(shù)提取物作用強(qiáng)

7、于丹參、水蛭提取物，72h時(shí)莪術(shù)、水蛭提取物作用強(qiáng)于丹參提取物。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示水蛭、丹參提取物可阻止HepG2 細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期，莪術(shù)提取物則使HepG2細(xì)胞被阻滯在S期，白花蛇舌草提取物對(duì)HepG2細(xì)胞周期無(wú)明顯影響。
　　 5．吖啶橙熒光染色：IC50藥物濃度處理后，HepG2細(xì)胞均可見(jiàn)典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，歸肝經(jīng)中藥提取物明顯，而非歸肝經(jīng)中藥白花蛇舌草提取物相對(duì)較少。
　　 結(jié)論：