帶hTERT啟動(dòng)子的腺病毒干擾ERCC1基因表達(dá)逆轉(zhuǎn)卵巢癌順鉑耐藥的研究.pdf

1、Y1407411分類號(hào)：R71175密級(jí)：學(xué)位類別；科學(xué)學(xué)位√口專業(yè)學(xué)位口◎?qū)W校代碼：學(xué)號(hào)：1006220051073又灃醬科^垮TlANJlNMEDICAlIUNlVERSITY博士學(xué)位論文DoCToRALDISSERTATIoN論文題目：帶hTERT啟動(dòng)予的腺病毒干擾ERCCl基因表達(dá)逆轉(zhuǎn)卵巢癌順鉑耐藥的研究TITLEStudyonadenoviruswithhTERTpromoterinterferingexpressionofE

2、RCCltoreverseeisplalinresistanceinovariancancercelllines一級(jí)學(xué)科：臨床醫(yī)學(xué)二級(jí)學(xué)科：婦產(chǎn)科學(xué)論文作者：任亞娟指導(dǎo)教師：糜若然教授導(dǎo)師組成員：瞿全新教授天津醫(yī)科大學(xué)研究生院二oO)t年五月天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文目的：構(gòu)建帶有hTERTpromoter的重組質(zhì)粒，并檢測(cè)hTERTpromoter表達(dá)的特異性。方法：1、使用KpnI／Hind111分別對(duì)質(zhì)粒pGL3BasicVecto

3、r和包含hTERTpromoter的質(zhì)粒CTS883P4進(jìn)行酶切；將hTERTpromoter片段亞克隆入pGL3Basic線性載體；對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，測(cè)序驗(yàn)證。2、用脂質(zhì)體法分別將重組質(zhì)粒pGL3hTERTpromoterLuc、陰性對(duì)照質(zhì)粒pGL3Basic、陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒pGL3Control轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞SKOV3、SKOV3／DDP和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304，24小時(shí)后于熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果：l、成功構(gòu)建了帶有hTER

4、Tpromoter的重組質(zhì)粒pGL3。hTERTpromoterLuc，經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證正確。2、轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒的SKOV3和SKOV3／DDP細(xì)胞能觀察到熒光，正常體細(xì)胞無(wú)熒光；轉(zhuǎn)染pGL3Basic質(zhì)粒的卵巢癌細(xì)胞和正常體細(xì)胞均未觀察到熒光。結(jié)論：hTERTpromoter只在腫瘤細(xì)胞中有活性，在正常體細(xì)胞中無(wú)活性。第二部分?jǐn)y帶hTERTpromoter和ERCClshRNA的質(zhì)粒表達(dá)載體的構(gòu)建及RNA干擾效果檢測(cè)目的：構(gòu)建帶有

5、hTERTpromoter和ERCClshRNA的質(zhì)粒表達(dá)載體。方法：l、構(gòu)建PMDl8ThTERTpromoter質(zhì)粒。2、構(gòu)建pDNR—lrshRNA表達(dá)載體。3、構(gòu)建pDNR1rhTERTpromotershRNA載體。4、采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞株SKOV3和耐藥細(xì)胞株SKOV3／DDP，以J下常體細(xì)胞作對(duì)照，觀察RNA干擾效果(mRNA水平)。5、在蛋白水平檢測(cè)ERCCl基因的RNA干擾效果。結(jié)果：l、成功構(gòu)建PMDl8Th

6、TERTpromoter質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序證實(shí)插入的外源基因序列正確：2、成功構(gòu)建pDNR一1rERCClshRNA表達(dá)載體。經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序證實(shí)插入的外源基因序列正確；3、成功構(gòu)建pDNRlrhTERTpromotershRNA載體，經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序證實(shí)插入的外源基因序列正確。4、RTPCR方法顯示，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后24、48、72h，SKOV3細(xì)胞內(nèi)ERCClmRNA分別下調(diào)(3502727)％，(4928246)％，(55544