錯(cuò)配修復(fù)基因hmlh1和hmsh2的表達(dá)與人卵巢癌順鉑耐藥的關(guān)系

1、<p>　　錯(cuò)配修復(fù)基因hMLH1 和hMSH2的表達(dá)與人卵巢癌順鉑耐藥的關(guān)系</p><p>　　李淵淵，鐘玲，何華，舒丹（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶 400010）</p><p>　　摘要：目的 探討DNA錯(cuò)配修復(fù)基因hMLH1和hMSH2的表達(dá)在人卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥現(xiàn)象中的作用。方法 MTT法檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，Hoechst免疫熒光染色檢測(cè)順鉑作用

2、下敏感及耐藥細(xì)胞的凋亡情況，并使用RT-PCR技術(shù)及Western blotting技術(shù)分別檢測(cè)順鉑敏感性人卵巢癌細(xì)胞及耐順鉑人卵巢癌細(xì)胞中錯(cuò)配修復(fù)基因hMLH1及hMSH2 的轉(zhuǎn)錄與翻譯表達(dá)變化。結(jié)果 同一順鉑濃度作用下，耐順鉑人卵巢癌細(xì)胞的凋亡率明顯低于順鉑敏感性人卵巢癌細(xì)胞，且后者的錯(cuò)配修復(fù)基因hMLH1 和hMSH2的mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著高于前者。結(jié)論 順鉑可誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡，錯(cuò)配修復(fù)基因hMLH1 和hMSH2在耐順

3、鉑人卵巢癌細(xì)胞中低表達(dá)可能是導(dǎo)致順鉑耐藥發(fā)生的重要原因。</p><p>　　關(guān)鍵詞：卵巢癌；順鉑；耐藥</p><p>　　Relationship between DNA mismatch repair gene hMLH1 and hMSH2 and chemoresistance in cisplatin-resistant human ovarian cancer cell li

4、ne SKOV3/DDP</p><p>　　Abstract: Objective To investigate the roles of hMLH1 and hMSH2 gene in cisplatin resistance in human ovarian cancer. Methods The chemosensitivity to cisplatin was measured by MTT assay

5、. The apoptosis induced by DDP was tested by Hoechst fluorescence analysis. The gene expression of hMLH1 and hMLH2 at transcription and translation levels in SKOV3 and SKOV3/DDP were measured by reverse transcription pol

6、ymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blotting, respectively. Results The apopototic rate</p><p>　　Key word: ovarian cancer；cisplatin；resistance</p><p>　　卵巢惡性腫瘤是女性生殖器三大惡性腫瘤之一。5年存活率較低，訖今仍徘徊

7、在25–30%。目前卵巢癌治療原則是以手術(shù)為主，輔以化療、放療的綜合治療。順鉑是目前治療卵巢癌的一線化療藥物，通過(guò)形成鉑-DNA絡(luò)合物導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷而產(chǎn)生細(xì)胞毒作用[1]，研究表明，順鉑可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[2]，但化療耐藥的形成嚴(yán)重制約著卵巢癌治愈率的提高。研究發(fā)現(xiàn)，DNA錯(cuò)配修復(fù)基因在DNA損傷修復(fù)過(guò)程中起重要作用，如MMR基因缺陷的腫瘤可以產(chǎn)生針對(duì)順鉑等化療藥物的耐受[3]。hMLH1和hMSH2基因是DNA錯(cuò)配修復(fù)系列基因中

8、最重要的兩種，亦是MMR家族的重要成員[4]。本研究通過(guò)比較耐順鉑人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3/DDP與順鉑敏感性人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3中hMLH1及hMSH2基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)水平的差異，探討錯(cuò)配修復(fù)基因hMLH1和hMSH2的表達(dá)與人卵巢癌順鉑耐藥的關(guān)系，旨在為逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)及理論支持。</p><p><b>　　1. 材料和方法</b></p><p&g

9、t;<b>　　1.1 材料</b></p><p>　　人卵巢癌SKOV3細(xì)胞，由姜歆碩士饋贈(zèng)；卵巢癌SKOV3順鉑耐藥細(xì)胞（SKOV3/DDP）購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院； RNA提取試劑盒購(gòu)于大連TaKaRa公司（中國(guó)）；RT-PCR試劑購(gòu)自杭州博日科技有限公司（中國(guó)）；hMLH1和hMSH2多克隆抗體均購(gòu)于美國(guó)sata cruz公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)于北京中杉金橋公司（中

10、國(guó)）；轉(zhuǎn)錄所用引物均由上海生物工程有限公司合成（中國(guó)）。</p><p><b>　　1.2方法</b></p><p>　　1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) </p><p>　　將SKOV3細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，于37 °C、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48 h換液1次，以1:3比例傳代。</p>

11、;<p>　　1.2.2 細(xì)胞活力分析</p><p>　　使用MTT分析檢測(cè)SKOV3細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。分別將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞以104/孔，接種于96孔板；待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的順鉑（2.5、5、10、20及40 μg/ml），每孔重復(fù)5次，置37 °C、 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；每孔加入20μl MTT（5 mg/ml），混勻后繼續(xù)孵育

12、3 h；棄上清，每孔加入二甲亞砜（DMSO）100 μl，震蕩10 min，于490 nm處測(cè)得各孔的吸光度（OD）值；按下述公式計(jì)算抑制率：抑制率（%）=[1–(OD實(shí)驗(yàn)組–OD空白組)/(OD對(duì)照組–OD空白組)]×100%</p><p>　　1.2.3 Hochest免疫熒光染色</p><p>　　SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞分別以104個(gè)孔濃度，接種于96孔板，

13、待細(xì)胞貼壁后，用順鉑（10 μg/ml）處理24 h。藥理處理完畢，棄上清，向各孔內(nèi)加入100 μl Hoechst 33342熒光染液（1.0 µg/ml），避光染色30 min，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。</p><p>　　1.2.4 RT-PCR檢測(cè)</p><p>　　使用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)SKOV3及SKOV3/DDP中hMLH1和hMSH2基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)變化。待細(xì)胞密

14、度達(dá)80-90%時(shí)，按RNA抽提試劑盒說(shuō)明提取總RNA。cDNA逆轉(zhuǎn)錄分析及擴(kuò)增體系詳見(jiàn)說(shuō)明書。 基因hMLH1引物序列如下（159 bp）： 5′-TTC GTG GCA GGG GTT ATT CG-3′（正義鏈）；5′-GCC TCC CTC TTT AAC AAT CAC TT-3′（反義鏈）?；騢MSH2引物序列如下（145bp）：5′-ACC AAA GGA ATG TGT TTT ACC CG-3′（正義鏈）；5′-CC

15、G GTT GAG GTC CTG ATA AAT GT-3′（反義鏈）。對(duì)照基因β-actin引物序列如下（678bp）：5'- ACTGTGCCCATCTACGAGG-3',5'-GAAAGGGTGTAACGCAACTA-3'。以β-actin為內(nèi)參，各實(shí)驗(yàn)組PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，使用Quantity One圖象分析軟件進(jìn)行半定量分析。</p><p>　　1. 2.

16、4 Western-blotting檢測(cè)</p><p>　　使用Western blotting技術(shù)檢測(cè)hMLH1和hMSH2基因在SKOV3和SKOV3/DDP中的蛋白表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)步驟如下所述：待細(xì)胞密度達(dá)80–90%時(shí)，按蛋白提取試劑盒說(shuō)明提取各實(shí)驗(yàn)組的總蛋白；對(duì)提取蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜操作后，分別進(jìn)行脫脂奶封閉、一抗孵育及二抗孵育；抗體孵育完畢，進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光成像分析；以β-act

17、in為內(nèi)參，使用Quantity One圖象分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行半定量分析。</p><p>　　1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理</p><p>　　應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用Student-t檢驗(yàn)結(jié)合方差分析，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。</p><p><b>　　2. 結(jié)果</b></p>

18、<p>　　2.1 順鉑對(duì)SKOV3及SKOV3/DDP細(xì)胞活力的抑制</p><p>　　分別用2.5、5、10、20、40 μg/ml順鉑處理細(xì)胞后，測(cè)定各組抑制率。結(jié)果見(jiàn)表一。</p><p>　　表一： 不同濃度順鉑作用24小時(shí)后細(xì)胞的抑制率（%） </p><p><b>

19、;　　* p<0.05</b></p><p>　　經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，在最低和最大濃度作用下，二者的抑制率無(wú)明顯差異；而在5-20μg/ml 之間，SKOV3/DDP的抑制率顯著低于SKOV3,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。</p><p>　　2.2 Hochest染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡</p><p>　　正常細(xì)胞的胞核經(jīng)Hochest染色后

20、，呈均勻淺藍(lán)色，無(wú)深染亮點(diǎn)。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，細(xì)胞核可呈藍(lán)色深染。如圖1示，經(jīng)順鉑（10 μg/ml）作用24h后，SKOV組（圖1A）的平均免疫熒光強(qiáng)度顯著高于SKOV3/DDP組（圖1B）（P<0.05），提示前者的細(xì)胞凋亡率要明顯高于后者。</p><p>　　圖1. Hochest免疫熒光染色</p><p>　　2.3 hMLH1和hMSH2基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)研究</p&

21、gt;<p>　　RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（圖3），在SKOV3/DDP細(xì)胞中，hMLH1和hMSH2基因的擴(kuò)增條帶亮度顯著低于SKOV3細(xì)胞（P<0.05），提示上述基因在SKOV3/DDP細(xì)胞中顯示出更高的轉(zhuǎn)錄水平。</p><p>　　圖2. hMLH1 mRNA在敏感及耐藥細(xì)胞中的表達(dá)</p><p>　　圖3.hMSH2 mRNA在敏感及耐藥細(xì)胞中的表達(dá)<

22、;/p><p>　　2.4 hMLH1和hMSH2基因的蛋白表達(dá)研究</p><p>　　Western-blot結(jié)果表明（圖4），與SKOV3細(xì)胞相比，SKOV3/DDP細(xì)胞中的hMLH1和hMSH2基因顯示出了更高的蛋白表達(dá)水平（P<0.05）。</p><p>　　圖4. hMLH1和hMSH2蛋白在敏感及耐藥細(xì)胞中的表達(dá)</p><p&

23、gt;<b>　　3. 討論</b></p><p>　　DNA錯(cuò)配修復(fù)（mismatch repair system, MMR）是人體細(xì)胞中存在的一種能識(shí)別并修復(fù)DNA堿基錯(cuò)配的安全保障系統(tǒng)，具有修復(fù)DNA堿基錯(cuò)配、增強(qiáng)DNA復(fù)制的忠實(shí)性、維持基因組穩(wěn)定性和降低自發(fā)性突變的功能[5] [6]。該系統(tǒng)中任何一種基因突變，均將導(dǎo)致細(xì)胞錯(cuò)配修復(fù)功能缺陷，最終產(chǎn)生遺傳體系的不穩(wěn)定性，表現(xiàn)為復(fù)制錯(cuò)誤

24、（replication errors，RER）或微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instable, MIS）[7]，從而具有較高的腫瘤發(fā)生率。錯(cuò)配修復(fù)基因具有識(shí)別 DNA損傷并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能[8]，因此，該基因表達(dá)情況影響著腫瘤細(xì)胞對(duì)一些化療藥物，尤其是致DNA損傷的化療藥物如順鉑的敏感性[9]。</p><p>　　腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生與膜（泵）蛋白、癌基因蛋白、抑癌基因蛋白、細(xì)胞周期蛋白、凋

25、亡蛋白、生長(zhǎng)因子及受體及某些酶類等多種蛋白的異常表達(dá)有關(guān)，而錯(cuò)配修復(fù)基因作為維護(hù)基因組穩(wěn)定的管家基因，其功能缺失常會(huì)導(dǎo)致微衛(wèi)星不穩(wěn)定和一些基因突變的增加，從而影響相應(yīng)基因蛋白的表達(dá)，并參與腫瘤細(xì)胞耐藥性的形成。研究發(fā)現(xiàn)，MMR基因缺陷的卵巢癌可產(chǎn)生化療藥物耐受[10]。</p><p>　　本研究采用MTT法檢測(cè)了順鉑敏感性人卵巢癌細(xì)胞及耐順鉑人卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的反應(yīng)差異。其在，Hochest熒光染色結(jié)果表明，在

26、相同的順鉑濃度作用下，敏感株細(xì)胞對(duì)順鉑的反應(yīng)要明顯強(qiáng)于耐藥株。此外，RT-PCR及western blotting實(shí)驗(yàn)證實(shí)，錯(cuò)配修復(fù)基因hMLH1和hMSH2在耐藥細(xì)胞中的表達(dá)明顯弱于敏感細(xì)胞。本研究通過(guò)卵巢癌敏感及耐藥細(xì)胞中錯(cuò)配修復(fù)基因的表達(dá)差異，初步探討了DNA錯(cuò)配修復(fù)基因hMLH1和hMSH2的表達(dá)在人卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥現(xiàn)象中的作用。</p><p>　　本研究證實(shí)：錯(cuò)配修復(fù)基因能夠識(shí)別烷化劑（如MNNG）

27、、抗代謝類藥（如 6-thioguanine）和一些鉑類藥物（如順鉑）引起的DNA損傷，并導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞的凋亡。鑒于錯(cuò)配修復(fù)基因表達(dá)缺失的腫瘤細(xì)胞易出現(xiàn)對(duì)上述化療藥物產(chǎn)生耐受，本研究將對(duì)卵巢癌細(xì)胞耐藥的臨床治療提供理論支持。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)：</b></p><p>　　[1] Wang,D.&Lippard,S.J. Cellular

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