錯配修復基因hmlh1和hmsh2的表達與人卵巢癌順鉑耐藥的關(guān)系

1、<p>　　錯配修復基因hMLH1 和hMSH2的表達與人卵巢癌順鉑耐藥的關(guān)系</p><p>　　李淵淵，鐘玲，何華，舒丹（重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶 400010）</p><p>　　摘要：目的 探討DNA錯配修復基因hMLH1和hMSH2的表達在人卵巢癌細胞順鉑耐藥現(xiàn)象中的作用。方法 MTT法檢測卵巢癌細胞對順鉑的敏感性，Hoechst免疫熒光染色檢測順鉑作用

2、下敏感及耐藥細胞的凋亡情況，并使用RT-PCR技術(shù)及Western blotting技術(shù)分別檢測順鉑敏感性人卵巢癌細胞及耐順鉑人卵巢癌細胞中錯配修復基因hMLH1及hMSH2 的轉(zhuǎn)錄與翻譯表達變化。結(jié)果 同一順鉑濃度作用下，耐順鉑人卵巢癌細胞的凋亡率明顯低于順鉑敏感性人卵巢癌細胞，且后者的錯配修復基因hMLH1 和hMSH2的mRNA及蛋白表達水平均顯著高于前者。結(jié)論 順鉑可誘導卵巢癌細胞凋亡，錯配修復基因hMLH1 和hMSH2在耐順

3、鉑人卵巢癌細胞中低表達可能是導致順鉑耐藥發(fā)生的重要原因。</p><p>　　關(guān)鍵詞：卵巢癌；順鉑；耐藥</p><p>　　Relationship between DNA mismatch repair gene hMLH1 and hMSH2 and chemoresistance in cisplatin-resistant human ovarian cancer cell li

4、ne SKOV3/DDP</p><p>　　Abstract: Objective To investigate the roles of hMLH1 and hMSH2 gene in cisplatin resistance in human ovarian cancer. Methods The chemosensitivity to cisplatin was measured by MTT assay

5、. The apoptosis induced by DDP was tested by Hoechst fluorescence analysis. The gene expression of hMLH1 and hMLH2 at transcription and translation levels in SKOV3 and SKOV3/DDP were measured by reverse transcription pol

6、ymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blotting, respectively. Results The apopototic rate</p><p>　　Key word: ovarian cancer；cisplatin；resistance</p><p>　　卵巢惡性腫瘤是女性生殖器三大惡性腫瘤之一。5年存活率較低，訖今仍徘徊

7、在25–30%。目前卵巢癌治療原則是以手術(shù)為主，輔以化療、放療的綜合治療。順鉑是目前治療卵巢癌的一線化療藥物，通過形成鉑-DNA絡(luò)合物導致細胞DNA損傷而產(chǎn)生細胞毒作用[1]，研究表明，順鉑可誘導腫瘤細胞的凋亡[2]，但化療耐藥的形成嚴重制約著卵巢癌治愈率的提高。研究發(fā)現(xiàn)，DNA錯配修復基因在DNA損傷修復過程中起重要作用，如MMR基因缺陷的腫瘤可以產(chǎn)生針對順鉑等化療藥物的耐受[3]。hMLH1和hMSH2基因是DNA錯配修復系列基因中

8、最重要的兩種，亦是MMR家族的重要成員[4]。本研究通過比較耐順鉑人卵巢癌細胞株SKOV3/DDP與順鉑敏感性人卵巢癌細胞株SKOV3中hMLH1及hMSH2基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯表達水平的差異，探討錯配修復基因hMLH1和hMSH2的表達與人卵巢癌順鉑耐藥的關(guān)系，旨在為逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥提供實驗依據(jù)及理論支持。</p><p><b>　　1. 材料和方法</b></p><p&g

9、t;<b>　　1.1 材料</b></p><p>　　人卵巢癌SKOV3細胞，由姜歆碩士饋贈；卵巢癌SKOV3順鉑耐藥細胞（SKOV3/DDP）購于廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院； RNA提取試劑盒購于大連TaKaRa公司（中國）；RT-PCR試劑購自杭州博日科技有限公司（中國）；hMLH1和hMSH2多克隆抗體均購于美國sata cruz公司；辣根過氧化物酶標記的二抗購于北京中杉金橋公司（中

10、國）；轉(zhuǎn)錄所用引物均由上海生物工程有限公司合成（中國）。</p><p><b>　　1.2方法</b></p><p>　　1.2.1 細胞培養(yǎng) </p><p>　　將SKOV3細胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，于37 °C、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48 h換液1次，以1:3比例傳代。</p>

11、;<p>　　1.2.2 細胞活力分析</p><p>　　使用MTT分析檢測SKOV3細胞對順鉑的敏感性。分別將處于對數(shù)生長期的SKOV3和SKOV3/DDP細胞以104/孔，接種于96孔板；待細胞貼壁后，加入不同濃度的順鉑（2.5、5、10、20及40 μg/ml），每孔重復5次，置37 °C、 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；每孔加入20μl MTT（5 mg/ml），混勻后繼續(xù)孵育

12、3 h；棄上清，每孔加入二甲亞砜（DMSO）100 μl，震蕩10 min，于490 nm處測得各孔的吸光度（OD）值；按下述公式計算抑制率：抑制率（%）=[1–(OD實驗組–OD空白組)/(OD對照組–OD空白組)]×100%</p><p>　　1.2.3 Hochest免疫熒光染色</p><p>　　SKOV3和SKOV3/DDP細胞分別以104個孔濃度，接種于96孔板，

13、待細胞貼壁后，用順鉑（10 μg/ml）處理24 h。藥理處理完畢，棄上清，向各孔內(nèi)加入100 μl Hoechst 33342熒光染液（1.0 µg/ml），避光染色30 min，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。</p><p>　　1.2.4 RT-PCR檢測</p><p>　　使用RT-PCR技術(shù)檢測SKOV3及SKOV3/DDP中hMLH1和hMSH2基因的轉(zhuǎn)錄表達變化。待細胞密

14、度達80-90%時，按RNA抽提試劑盒說明提取總RNA。cDNA逆轉(zhuǎn)錄分析及擴增體系詳見說明書。 基因hMLH1引物序列如下（159 bp）： 5′-TTC GTG GCA GGG GTT ATT CG-3′（正義鏈）；5′-GCC TCC CTC TTT AAC AAT CAC TT-3′（反義鏈）?；騢MSH2引物序列如下（145bp）：5′-ACC AAA GGA ATG TGT TTT ACC CG-3′（正義鏈）；5′-CC

15、G GTT GAG GTC CTG ATA AAT GT-3′（反義鏈）。對照基因β-actin引物序列如下（678bp）：5'- ACTGTGCCCATCTACGAGG-3',5'-GAAAGGGTGTAACGCAACTA-3'。以β-actin為內(nèi)參，各實驗組PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，使用Quantity One圖象分析軟件進行半定量分析。</p><p>　　1. 2.

16、4 Western-blotting檢測</p><p>　　使用Western blotting技術(shù)檢測hMLH1和hMSH2基因在SKOV3和SKOV3/DDP中的蛋白表達變化。實驗步驟如下所述：待細胞密度達80–90%時，按蛋白提取試劑盒說明提取各實驗組的總蛋白；對提取蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜操作后，分別進行脫脂奶封閉、一抗孵育及二抗孵育；抗體孵育完畢，進行ECL化學發(fā)光成像分析；以β-act

17、in為內(nèi)參，使用Quantity One圖象分析軟件對實驗結(jié)果進行半定量分析。</p><p>　　1.3 統(tǒng)計學處理</p><p>　　應用SPSS10.0統(tǒng)計軟件，采用Student-t檢驗結(jié)合方差分析，對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，P<0.05為具有統(tǒng)計學差異。</p><p><b>　　2. 結(jié)果</b></p>

18、<p>　　2.1 順鉑對SKOV3及SKOV3/DDP細胞活力的抑制</p><p>　　分別用2.5、5、10、20、40 μg/ml順鉑處理細胞后，測定各組抑制率。結(jié)果見表一。</p><p>　　表一： 不同濃度順鉑作用24小時后細胞的抑制率（%） </p><p><b>

19、;　　* p<0.05</b></p><p>　　經(jīng)統(tǒng)計學處理，在最低和最大濃度作用下，二者的抑制率無明顯差異；而在5-20μg/ml 之間，SKOV3/DDP的抑制率顯著低于SKOV3,差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。</p><p>　　2.2 Hochest染色檢測細胞凋亡</p><p>　　正常細胞的胞核經(jīng)Hochest染色后

20、，呈均勻淺藍色，無深染亮點。當細胞發(fā)生凋亡時，細胞核可呈藍色深染。如圖1示，經(jīng)順鉑（10 μg/ml）作用24h后，SKOV組（圖1A）的平均免疫熒光強度顯著高于SKOV3/DDP組（圖1B）（P<0.05），提示前者的細胞凋亡率要明顯高于后者。</p><p>　　圖1. Hochest免疫熒光染色</p><p>　　2.3 hMLH1和hMSH2基因的轉(zhuǎn)錄表達研究</p&

21、gt;<p>　　RT-PCR實驗結(jié)果表明（圖3），在SKOV3/DDP細胞中，hMLH1和hMSH2基因的擴增條帶亮度顯著低于SKOV3細胞（P<0.05），提示上述基因在SKOV3/DDP細胞中顯示出更高的轉(zhuǎn)錄水平。</p><p>　　圖2. hMLH1 mRNA在敏感及耐藥細胞中的表達</p><p>　　圖3.hMSH2 mRNA在敏感及耐藥細胞中的表達<

22、;/p><p>　　2.4 hMLH1和hMSH2基因的蛋白表達研究</p><p>　　Western-blot結(jié)果表明（圖4），與SKOV3細胞相比，SKOV3/DDP細胞中的hMLH1和hMSH2基因顯示出了更高的蛋白表達水平（P<0.05）。</p><p>　　圖4. hMLH1和hMSH2蛋白在敏感及耐藥細胞中的表達</p><p&

23、gt;<b>　　3. 討論</b></p><p>　　DNA錯配修復（mismatch repair system, MMR）是人體細胞中存在的一種能識別并修復DNA堿基錯配的安全保障系統(tǒng)，具有修復DNA堿基錯配、增強DNA復制的忠實性、維持基因組穩(wěn)定性和降低自發(fā)性突變的功能[5] [6]。該系統(tǒng)中任何一種基因突變，均將導致細胞錯配修復功能缺陷，最終產(chǎn)生遺傳體系的不穩(wěn)定性，表現(xiàn)為復制錯誤

24、（replication errors，RER）或微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instable, MIS）[7]，從而具有較高的腫瘤發(fā)生率。錯配修復基因具有識別 DNA損傷并誘導細胞凋亡的功能[8]，因此，該基因表達情況影響著腫瘤細胞對一些化療藥物，尤其是致DNA損傷的化療藥物如順鉑的敏感性[9]。</p><p>　　腫瘤細胞耐藥性的產(chǎn)生與膜（泵）蛋白、癌基因蛋白、抑癌基因蛋白、細胞周期蛋白、凋

25、亡蛋白、生長因子及受體及某些酶類等多種蛋白的異常表達有關(guān)，而錯配修復基因作為維護基因組穩(wěn)定的管家基因，其功能缺失常會導致微衛(wèi)星不穩(wěn)定和一些基因突變的增加，從而影響相應基因蛋白的表達，并參與腫瘤細胞耐藥性的形成。研究發(fā)現(xiàn)，MMR基因缺陷的卵巢癌可產(chǎn)生化療藥物耐受[10]。</p><p>　　本研究采用MTT法檢測了順鉑敏感性人卵巢癌細胞及耐順鉑人卵巢癌細胞對順鉑的反應差異。其在，Hochest熒光染色結(jié)果表明，在

26、相同的順鉑濃度作用下，敏感株細胞對順鉑的反應要明顯強于耐藥株。此外，RT-PCR及western blotting實驗證實，錯配修復基因hMLH1和hMSH2在耐藥細胞中的表達明顯弱于敏感細胞。本研究通過卵巢癌敏感及耐藥細胞中錯配修復基因的表達差異，初步探討了DNA錯配修復基因hMLH1和hMSH2的表達在人卵巢癌細胞順鉑耐藥現(xiàn)象中的作用。</p><p>　　本研究證實：錯配修復基因能夠識別烷化劑（如MNNG）

27、、抗代謝類藥（如 6-thioguanine）和一些鉑類藥物（如順鉑）引起的DNA損傷，并導致卵巢癌細胞的凋亡。鑒于錯配修復基因表達缺失的腫瘤細胞易出現(xiàn)對上述化療藥物產(chǎn)生耐受，本研究將對卵巢癌細胞耐藥的臨床治療提供理論支持。</p><p><b>　　參考文獻：</b></p><p>　　[1] Wang,D.&Lippard,S.J. Cellular

28、processing of platinum anticancer drugs [J]. Nat.Rev. DrugDiscov. 2005,4:307–320. </p><p>　　[2] SiddikZ.H. Cisplatin: mode of cytotoxic action and molecular basis of resistance.Oncogene2003;22:7265–79.</p

29、><p>　　[3] Peltomaki P. Deficient DNA mismatch repair: a common etiologic factor for colon cancer [J]. Human Molecular Genetics,2001,10:735-740. </p><p>　　[4] Ming-Hong Tsai,Woei-Horng 

30、Fang,Shu-Wha Lin,et a1.Mitochondrial Genomic Instability in Colorectal Cancer: No Correlation to Nuclear Microsatellite Instability and Allelic Deletion of hMSH2, hMLH1, and p53 Genes, but Prediction of Better Survi

31、val for Dukes’ Stage C Disease [J]. Annals of Surgical Oncology, 2009,16:2918-2925.</p><p>　　[5] Harfe BD, Jinks-Robertson S. DNA mismatch repair and genetic stability [J]. Annu Rev Genet, 2000,34:359-399.&l

32、t;/p><p>　　[6] 劉 卓 吳建新. DNA錯配修復系統(tǒng)組成和功能的研究進展.[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學進展,2008,1160-1165.</p><p>　　[7] Picard SF, Franco N, Sergent C, et a1. Analysis of microsatellite instability in acquired drug resistanxe huma

33、n tunor cell lines [J]. Oncol Rep,2002, 9 (5):97l-976.</p><p>　　[8] 李 梅， 呂 申. 錯配修復功能缺失對腫瘤細胞耐藥性的影響[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學,2007,15(9):1348-1340.</p><p>　　[9] Fishel R. The selection for mismatch repair defect

34、s in hereditary nonpolyposis colorectal cancer: revising the mutator hypothesis [J]. Cancer Res,2001,15 ( 20):7369-7374. </p><p>　　[10] Chancy SG, Campbell SL, Temple B, et al. Protein interactions with pl